劉　洋，靳秋月，段美慶，樊淑珍，陳立軍※

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010059； 2.武警后勤學(xué)院生物化學(xué)教研室，天津 300309)

STAT3基因siRNA表達載體的構(gòu)建及鑒定

劉洋1，靳秋月2，段美慶1，樊淑珍1，陳立軍2※

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010059； 2.武警后勤學(xué)院生物化學(xué)教研室，天津 300309)

摘要：目的利用RNA干擾技術(shù)，以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)為靶基因，設(shè)計構(gòu)建重組體，并進行序列分析鑒定。方法設(shè)計一條有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增合成siRNA表達框架(SECs)表達框架，克隆至載體psiLentGeneTM中構(gòu)建重組體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定后測序分析。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅤ酶切、電泳、測序分析表明插入序列正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)論成功構(gòu)建了STAT3靶向RNA干擾重組體，為腫瘤的基因治療在分子水平、細胞水平和整體水平的研究提供一些新方法。

關(guān)鍵詞：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；RNA干擾；質(zhì)粒

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種重要機制，其是通過核酸酶切割雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA),將其變成21～25 nt的小干擾RNA(small minterfering RNA，siRNA)，通過siRNA介導(dǎo)識別，然后靶向切割同源性信使RNA分子而實現(xiàn)的[1-2]。RNAi技術(shù)是一種高效的特定基因表達調(diào)控的新技術(shù)，作為分子生物學(xué)研究的重要工具之一，被廣泛用于功能基因組研究以及腫瘤基因治療研究[3-7]。siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一段DNA序列，該序列可在哺乳動物細胞中表達siRNA，其由3部分組成，包括RNA聚合酶啟動子、發(fā)夾式siRNA模板以及RNA聚合酶終止子，RNA聚合酶Ⅲ能夠識別啟動子，從而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA分子，進一步引發(fā)RNAi[8-10]。本實驗成功構(gòu)建了針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription，STAT3)的siRNA表達載體，這為沉默STAT3基因的表達及腫瘤的靶向治療提供了基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料E.coli DH5α感受態(tài)細胞及質(zhì)粒提取試劑盒均由北京天根公司提供；產(chǎn)物純化試劑盒由美國PROMEGA公司提供；Marker由北京天根公司提供。Luria-Bertani(LB)液體及固體培養(yǎng)基自行配置。STAT3基因片段由上海賽百盛公司合成。

1.2方法

1.2.1設(shè)計STAT3特異性的siRNA通過查詢Genebank，獲取人的STAT3信使RNA全序列(序列號：NM003150)。根據(jù)干擾RNA設(shè)計原則，尋找到干擾RNA的靶序列。確認(rèn)此靶向基因是唯一的、對于STAT3是特異的，且此部位無堿基多態(tài)性，同時不會抑制其他基因的表達。該序列經(jīng)過BIast，搜尋EST基因庫得到。1426～1444的核苷酸堿基序TTGAATTCTGCAGAGAGGC為RNA的干擾序列。按照天根公司的siLentGeneTMU6盒提供的干擾RNA引物設(shè)計原則，構(gòu)建序列下游引物。該引物須包括：5′磷酸堿基、局部的EcoRⅤ序列、U6終止序列、回文莖環(huán)結(jié)構(gòu)(由靶序列和袢環(huán)以及靶序列的反義互補組成)以及U6盒的配對序列，引物序列為5′-ATCTAAAAAGCCTCTCTGCAGAATTCAATCTCTTGAATTGAA-TTCTGCAGAGAGGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA -3′。

1.2.2SECs的體外合成用試劑盒擴增發(fā)夾結(jié)構(gòu)，用siLentGeneTM聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR) DNA純化系統(tǒng)進行PCR產(chǎn)物純化，最后用2%瓊脂糖進行純化產(chǎn)物凝膠分析。

1.2.3載體與siRNA模板的連接將前期純化好的PCR產(chǎn)物與psiLentGeneTM載體建立連接體系，充分混勻，室溫孵育1 h。同時設(shè)置空質(zhì)粒對照。

1.2.4連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒用熱激方法分別轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞大腸埃希菌DH5α中，將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞加到含氨芐西林抗生素的LB固體培養(yǎng)基，用無菌彎頭玻棒均勻涂開細胞，把平板倒置，37 ℃培養(yǎng)12～16 h[11-12]。

1.2.5陽性重組克隆的篩選通過藍白斑法，挑選白色菌落接種到含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃溫箱中振蕩過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)的細菌菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒提取可能的菌落質(zhì)粒[13]。

1.2.6重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒用EcoR Ⅴ限制性內(nèi)切酶進行酶切，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，酶切產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司進行測序分析。

2結(jié)果

2.1SECs的體外合成以發(fā)夾式siRNA模板寡聚核苷酸為模板合成SECs，2%瓊脂糖凝膠電泳，SECs條帶位置在300 bp左右(圖1) 。

2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定質(zhì)粒psiLentGeneTM上含有EcoR Ⅴ的酶切位點，插入目的基因片段后，如若插入正確，則能被EcoRⅤ酶切出一條約為300 bp的小帶和一條大小相似于原載體約4000 bp的條帶。堿裂解法小量提取質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA用EcoR Ⅴ酶切，酶切后的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中得到了大小為4000 bp和300 bp的條帶(圖2)。

2.3測序結(jié)果由PCR合成的STAT3-siRNA表達盒，凝膠電泳顯示合成片段的大小與實驗設(shè)計相符，約為300 bp，經(jīng)過測序分析證實STAT3-siRNA表達盒的序列與實驗設(shè)計序列相符，共474 bp。序列由大連寶生物工程有限公司進行測序，由此來證實所得到的重組載體序列正確(圖3)。

1、2、3、4：SECs；5：Marker

1：空質(zhì)粒；2、3：EcoRⅤ酶切圖；4:Marker

注：STAT3-siRNA表達盒序列測序結(jié)果與設(shè)計的約300 bp干擾序列完全一致

圖3重組載體測序圖

3討論

STAT蛋白家族能夠被不同的細胞因子受體激活，是細胞因子與受體相互作用的載體，其能保持信號在細胞內(nèi)傳遞的特異性。在STAT蛋白家族中，異常活化的STAT3及其相關(guān)基因與許多惡性腫瘤關(guān)系密切[14]。研究表明，酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常與一些疾病關(guān)系密切，STAT3的異常高表達和持續(xù)激活存在于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤細胞和組織中，其對于腫瘤細胞的形成、增殖、凋亡抑制等過程有重要作用[15-19]。

沉默STAT3基因可能會給腫瘤治療帶來新的方向，目前有多種方法可抑制基因的表達，但研究的焦點還是RNAi，尤其是siRNA[20-22]。許多研究表明，siRNA可高效阻斷哺乳動物細胞中某些特定基因的表達[23-24]。與RNA正義和反義RNA基因干涉相比，siRNA的效果更強、持續(xù)時間更長，甚至可延續(xù)到下一代，其也不受注射部位的影響。

目前，siRNA的研究多采用體外轉(zhuǎn)錄法、PCR法、RNA合成法、質(zhì)粒或病毒載體法等[25]。體外合成siRNA比較方便，其抑制效果也較好，容易實現(xiàn)，適合快速篩選所需要的序列，但不能用于長期介導(dǎo)RNAi，用于基因治療時RNA會被RNase降解，因此無法滿足動物和人體研究的要求。此外，還有一個重要問題，即RNAi衰減，對于低級生物，dsRNA或siRNA產(chǎn)生的RNAi能夠穩(wěn)定表達，并產(chǎn)生放大效應(yīng)；但在較高級的哺乳動物和人類細胞內(nèi)缺少RNAi的放大機制，在原代細胞中有時會對導(dǎo)入的dsRNA或siRNA產(chǎn)生拮抗，在轉(zhuǎn)染陽性的細胞內(nèi)這種現(xiàn)象在數(shù)天后會慢慢消失[25]。雖然siRNA表達載體需要克隆，且需要經(jīng)過序列檢測來證實，但這種方法容易大量擴增載體，且構(gòu)建好的質(zhì)粒可長期使用，是一種可以進行長期研究的方法。一般使用的siRNA表達載體是能夠在哺乳動物細胞中有效表達的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA，它是含有RNA聚合酶Ⅲ啟動子的載體[26]，如人源H1啟動子和人源或鼠源U6啟動子，它們的區(qū)別僅是轉(zhuǎn)錄起始點的堿基稍有不同，這些啟動子能夠在哺乳動物細胞中由RNA聚合酶Ⅲ啟動子操縱一段小的發(fā)夾siRNA表達干擾作用。U6啟動子在細胞內(nèi)表達豐富，其能夠精確地起始和終止真核細胞內(nèi)RNA的轉(zhuǎn)錄：限制性內(nèi)切酶正好切斷U6啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位置，能直接插入siRNA序列，轉(zhuǎn)錄后不需要切除額外堿基[27]。本研究設(shè)計時，在RNA聚合酶Ⅲ啟動子與4～5個T(終止RNA的轉(zhuǎn)錄)之間插入一段反向重復(fù)的回文序列，兩個反向重復(fù)序列間有一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)最好是由9個堿基的間隔區(qū)來形成，從G或A開始轉(zhuǎn)錄，于轉(zhuǎn)錄終止位置的第2個堿基處終止，最后折疊成一個具有3′UU突出末端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)，Dicer將該結(jié)構(gòu)切割成具有活性的siRNA分子，最終發(fā)揮RNAi作用。該表達載體具有以下優(yōu)勢：①操作過程比較簡單，不用提取對實驗條件要求苛刻的RNA；②能夠長時間抑制目的基因的表達；③可以復(fù)制擴增載體(如質(zhì)粒或病毒)[28]，與化學(xué)合成法相比，可顯著降低制備siRNA的成本。該方法適用于研究需要用抗生素篩選才能表達siRNA的細胞和維持較長時間基因沉默的細胞，不適用于siRNA序列篩選。目前，質(zhì)粒法已成為研究的熱點。

該實驗成功地構(gòu)建了能夠阻斷STAT3基因表達的干擾RNA序列，并同時將該序列克隆到載體psiLentGeneTM中，其為今后的研究打下了堅實的基礎(chǔ)，為腫瘤的基因治療在分子水平、細胞水平和整體水平的研究提供一些新方法。

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The Building and Identification of siRNA STAT3 Gene Expression Vector

LIUYang1，JINQiu-yue2，DUANMei-qing1，F(xiàn)ANShu-zheng1，CHENLi-jun2

(1.DepartmentofLaboratoryAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010059,China; 2.DepartmentofBiochemistry，LogisticsInstituteofPolice，Tianjin300309,China)

Abstract：ObjectiveThis study used RNA interference technology,selected STAT3 gene as the target,and then design and construction a recombinant vector and then identification the gene sequence analysis.MethodsDesign a DNA sequence with a small hairpin structure,PCR amplification a siRNA expression cassettes,cloning vector to construct recombinants in psiLentGeneTM into E.coli DH5α strain,extract plasmid after enzyme digestion sequencing.ResultsRecombinant plasmid by EcoR Ⅴ enzyme,electrophoresis and Sequencing analysis showed that the inserted sequence is correct,the recombinant plasmids were successfully constructed. ConclusionThe successful construction of STAT3 targeted RNA interference recombinant,provides some new methods for gene therapy of cancer research at the molecular level,cellular level and the overall level of.

Key words：Signal transduction and activators of transcription3; RNA interference; Plasmid

收稿日期：2014-04-15修回日期：2014-11-27編輯：辛欣

基金項目：武警醫(yī)學(xué)院總部級科研項目(WKH2006-6)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.053

中圖分類號：R735.35

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)04-0715-04