王振威,吳　靜,張占東,袁　媛

(1.唐山市婦幼保健院普外科，河北 唐山 063000; 2.唐山市眼科醫(yī)院內(nèi)科，河北 唐山 063000)

免疫組織化學和聚合酶鏈反應(yīng)在乳腺癌易患基因檢測中的應(yīng)用價值

王振威1※,吳靜2,張占東1,袁媛1

(1.唐山市婦幼保健院普外科，河北 唐山 063000; 2.唐山市眼科醫(yī)院內(nèi)科，河北 唐山 063000)

摘要：目的探討免疫組織化學和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在檢測乳腺癌易患基因中的應(yīng)用價值。方法選取2013年10月至2014年10月唐山市婦幼保健院診治的乳腺癌患者37例為乳腺癌組，良性乳腺疾病患者37例為良性乳腺疾病組，健康體檢者37例為正常組，均行免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因。結(jié)果乳腺癌組乳腺癌易患基因1、乳腺癌易患基因1/β2微球蛋白分別為(1.13±0.51)×105拷貝/L、(0.37±0.12)，均低于正常組[(3.09±1.38)×105拷貝/L、(0.95±0.36)]和良性乳腺疾病組[(2.87±1.40)×105拷貝/L、(0.93±0.41)]，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。乳腺癌組乳腺癌易患基因人表皮因子受體2(Her2)、細胞角蛋白5/6(CK5/6)、表皮生長因子受體(EGFR)分別為(6.75±2.98)×109拷貝/L、(25.84±11.43)×108拷貝/L、(43.54±18.26)×107拷貝/L，均顯著高于正常組[(3.65±1.40)×109拷貝/L、(2.69±0.54)×108拷貝/L、(2.18±0.90)×107拷貝/L]和良性乳腺疾病組[(3.80±1.31)×109拷貝/L、(2.76±0.68)×108拷貝/L、(2.27±1.04)×107拷貝/L]，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。乳腺癌組β2微球蛋白低于正常組和良性乳腺疾病組。行Her2檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均高于免疫組織化學檢測。結(jié)論免疫組織化學和PCR檢測均可用于乳腺癌易患基因的診斷，其中PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度更高。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；免疫組織化學；聚合酶鏈反應(yīng)；易患基因；評估

乳腺癌是臨床常見病癥，也是女性最為常見的惡性腫瘤疾病，具有較高的發(fā)病率[1-2]，直接影響著患者的預(yù)后狀況。近年來，乳腺癌易患基因1、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)、細胞角蛋白5/6(cytokeratin 5/6，CK5/6)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)逐漸成為了研究熱點，為乳腺癌患者的治療與預(yù)后提供了重要的科學依據(jù)[3-4]。目前，臨床檢測乳腺癌易患基因的方法有很多，其中免疫組織化學和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測較為常用[5-6]。為了探討免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因在乳腺癌療效的評估效果，本研究采用免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年10月至2014年10月唐山市婦幼保健院診治的乳腺癌患者37例為乳腺癌組，均符合《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》的診斷標準[7]，經(jīng)臨床表現(xiàn)、實驗室檢測、影像學檢查、病理組織學檢查確診，排除患有器質(zhì)性疾病、血液性疾病、免疫性疾病、感染性疾病、精神疾病的患者。患者年齡 27～62歲，平均(41.6±5.1)歲，體質(zhì)量39～72 kg，平均(49.2±3.9) kg。良性乳腺疾病患者37例為良性乳腺疾病組，年齡25～63歲，平均(40.9±5.5)歲，體質(zhì)量38～74 kg，平均(49.1±3.4) kg。健康體檢人員37例為正常組，年齡24～65歲，平均(41.2±5.6)歲，體質(zhì)量40～71 kg，平均(49.1±3.6) kg。三組年齡、體質(zhì)量等比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已取得患者及家屬同意，簽訂患者知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學檢測將病理標本取材后，經(jīng)4%甲醛固定，然后組織脫水，進行石蠟包埋，實施蘇木精染色和彈力纖維染色，最后免疫組織化學染色。此次研究的標志物為β2微球蛋白、乳腺癌易患基因1、Her2、CK5/6、EGFR，在光學顯微鏡下進行觀察，抗體表達于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜，如果出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，可認定為陽性細胞，同一切片內(nèi)陽性細胞數(shù)所占同類細胞術(shù)10%以上，可認定為結(jié)果陽性[4]。

1.2.2PCR檢測首先要提取組織RNA，將組織放入液氮中進行研磨，變成粉末后，將50 g組織置入Trizol 1 mL裂解，在室溫下靜置5 min，加入氯仿200 μL，劇烈震蕩15 s，充分混合，室溫下靜置5 min，4 ℃下離心15 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑12 cm。將離心后混合物分三相，上層水相移至1.5 mL離心管中，按異丙醇0.5 mL/Trizol 1 mL加入異丙醇，充分混勻，室溫下靜置10 min，4 ℃下離心10 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min。RNA會在離心管底部和側(cè)面形成白色沉淀，去上清，按1∶1比例加入75%乙醇，充分混勻，4 ℃下離心5 min，轉(zhuǎn)速10 600 r/min。去上清，在室溫下靜置10 min，讓RNA沉淀干燥，然后加入焦碳酸二乙酯水溶解，測定核酸濃度時波長260 nm，測定蛋白質(zhì)濃度時波長280 nm，核酸/蛋白質(zhì)比值為1.8～2.1，可認定為RNA提取成功，將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄操作步驟取滅菌、無核酸酶0.2 mLPCR反應(yīng)管，依次加入總RNA、Oligo dT Primer 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，焦碳酸二乙酯水定容到20 μL，以轉(zhuǎn)速2000 r/min離心30 s，擴增條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.4PCR擴增操作步驟取0.2 mLPCR反應(yīng)管，在冰上依次加入2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物、單鏈DNA各1 μL，超純水加至25 μL，以轉(zhuǎn)速2000 r/min離心30 s。上機擴增，94 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)1次，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，總延伸72 ℃ 2 min，將產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳。PCR引物及試劑盒均購自于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳操作步驟制備1%瓊脂糖凝膠備用。取1 μL預(yù)染液Gel-dye和PCR產(chǎn)物充分混合，加樣，恒壓電泳，每隔10 min在紫外燈投射下觀察，40 min后在凝膠電泳成像系統(tǒng)下觀察，記錄結(jié)果。

結(jié)果認定：根據(jù)標準曲線，儀器可自動計算拷貝數(shù)，將人工合成的標準品稀釋10倍，觀察相關(guān)系數(shù)的改變，設(shè)定確定線性范圍在105～109拷貝/L為正常范圍，低于正常范圍為陽性[3]。

2結(jié)果

2.1各組乳腺癌易患基因1與β2微球蛋白表達比較 乳腺癌組乳腺癌易患基因1、乳腺癌易患基因1/β2微球蛋白均低于正常組和良性乳腺疾病組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，三組β2微球蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組乳腺癌易患基因1與β2微球蛋白表達比較　±s)

正常組：健康體檢者；a與正常組比較，P<0.05；b與良性乳腺癌疾病比較，P<0.05

2.2各組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR表達比較 兩組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。乳腺癌組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR均明顯高于正常組和良性乳腺疾病組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　各組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR表達比較　

Her2:人表皮因子受體2;CK5/6:細胞角蛋白5/6;EGFR:表皮生長因子受體; 正常組：健康體檢者；a與正常組比較,P<0.05;b與良性乳腺疾病組比較,P<0.05

2.3乳腺癌組乳腺癌易患基因陽性表達比較 PCR檢測的乳腺癌易患基因1陽性率、CK5/6陽性率、EGFR陽性率均明顯高于免疫組織化學檢測，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組Her2陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　乳腺癌組患者乳腺癌易患基因陽性表達比較　[例(%)]

PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；Her2:人表皮因子受體2;CK5/6:細胞角蛋白5/6;EGFR:表皮生長因子受體

2.4免疫組織化學和PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度比較 行乳腺癌易患基因1、CK5/6、EGFR檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均明顯高于免疫組織化學檢測。行Her2檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均高于免疫組織化學檢測。見表4。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%[8-9]，在婦女僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要病因。乳腺癌的病因尚未完全清楚，但患者存在乳腺癌易患基因1、Her2、CK5/6、EGFR，在疾病的進展過程中出現(xiàn)了改變，分析如下。①乳腺癌易患基因1。乳腺癌易患基因1是一種常見的人乳腺癌易患基因，定位于染色體17q21D17s1321～D17s1325，屬于抑癌基因，在抑制細胞生長、細胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)及凋亡中發(fā)揮著重要的作用，不僅參與了細胞活動，還能有效維持基因穩(wěn)定性。通常情況下，乳腺癌易患基因1在正常組織中表達水平相對高，是因為腫瘤組織低表達而造成的，其實為正常表達水平。研究表明，乳腺癌易患基因1與乳腺癌早期發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。②Her2。Her2是迄今為止乳腺癌中研究較為透徹的基因之一，基因的過表達不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)外，還是一個重要的臨床治療監(jiān)測及預(yù)后指標，并且是腫瘤靶向治療藥物選擇的一個重要靶點，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12-13]，其擴增和過表達患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早，無病生存期較短，預(yù)后效果較差，對臨床治療與預(yù)后評估的意義重大。③CK5/6。CK5/6是一種上皮特異性標志物，是上皮源性腫瘤細胞骨架的組成成分，屬于多基因家族之一，其成員超過30種，在上皮性腫瘤組織中具有較高水平的表達，尤其是乳腺癌[14-15]。由于CK5/6具有高度的上皮組織特異性，在乳腺癌細胞中呈廣泛表達，因而CK5/6可作為檢測乳腺癌患者腫瘤細胞的一個有效指標。④EGFR。EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物，是EGFR家族成員之一,在細胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR廣泛分布于上皮細胞、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)細胞等細胞表面，其信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR過表達可造成腫瘤細胞增殖、血管生成、促進轉(zhuǎn)移、抑制凋亡，進而惡化患者病情，影響患者的預(yù)后[16-17]。

表4　免疫組織化學和PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度比較　(%)

PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；Her2:人表皮因子受體2;CK5/6:細胞角蛋白5/6;EGFR:表皮生長因子受體

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組乳腺癌易患基因1、乳腺癌易患基因1/β2微球蛋白均顯著低于正常組和良性乳腺疾病組，說明乳腺癌患者體內(nèi)乳腺癌易患基因1降低幅度很大，與疾病的嚴重程度密切相關(guān)。乳腺癌組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR均顯著高于正常組和良性乳腺疾病組，說明乳腺癌患者體內(nèi)乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR均出現(xiàn)了過表達現(xiàn)象，這與上述分析結(jié)果一致。

目前，臨床檢測乳腺癌易患基因的方法有很多，其中免疫組織化學和PCR檢測較為常用。免疫組織化學利用了免疫學基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究方法，也可稱為免疫組織化學技術(shù)或免疫細胞化學技術(shù)。免疫組織化學操作簡單，可行性高，結(jié)果讀取方便，耗時較少，費用較低，適用于臨床大批量檢測，但容易受到組織標本處理和觀察者主觀判斷的影響，可造成結(jié)果偏差。

PCR還可稱為無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。

本研究結(jié)果顯示，PCR檢測的乳腺癌易患基因1陽性率、CK5/6陽性率、EGFR陽性率均明顯高于免疫組織化學檢測，說明PCR檢測的陽性檢出率更高。行乳腺癌易患基因1、CK5/6、EGFR檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均明顯高于免疫組織化學檢測，說明PCR檢測的應(yīng)用價值更高，結(jié)果更加真實可靠。兩種檢測方法的檢測結(jié)果具有較高的一致性。

綜上所述，免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因均可用于乳腺癌評價，其中PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度更高。但本研究也存在一定的弊端，樣本量較少，仍需要進一步擴大，沒有進行動態(tài)觀察，需要進一步研究探討。

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Evaluation of Immunohistochemistry and PCR in Test of Susceptible Gene ofBreast Cancer

WANGZhen-wei1,WUJing2,ZHANGZhan-dong1,YUANYuan1.

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TangshanMaternalandChildHealthCareHospital,Tangshan063000,China; 2.DepartmentofInternalMedicine,TangshanOphthalmologyHospital,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application value of immunohistochemistryand polymerase chain reaction(PCR) in breast cancer susceptibility gene detection.MethodsTotal of 37 patients with breast cancer were selected in Tangshan Maternal and Child Health Care Hospital from Oct.2013 to Oct.2014 were included as breast cancer group,37 patients with benign breast disease were included as benign breast disease group,and 37 healthy persons as normal group.All people received breast cancer susceptibility gene detection of immunohistochemistry and PCR.ResultsBreast cancer susceptibility gene 1,breast cancer susceptibility gene 1/β2microglobulin in the breast cancer group were (1.13±0.51)×105copies/L,(0.37±0.12),both lower than the control group [(3.09±1.38)×105copies/L,(0.95±0.36)] and benign breast disease group [(2.87±1.40)×105copies/L,(0.93±0.41)],the differences were statistically significant(P<0.05).Breast cancer susceptibility genes human epidermal growth factor receptor 2(Her2),cytokeratin 5/6(CK5/6),epidermal growth factor receptor(EGFR) in breast cancer group were (6.75±2.98)×109copies/L,(25.84±11.43)×108copies/L,(43.54±18.26)×107copies/L respectively,significantly higher than the normal group [(3.65±1.40)×109copies /L,(2.69±0.54)×108copies/L,(2.18±0.90)×107copies/L] and benign breast disease group [(3.80±1.31)×109copies/L,(2.76±0.68)×108copies/L,(2.27±1.04)×107copies/L],the differences were statistically significant(P<0.05).β2microglobulin in breast cancer group was lower than the normal group and benign breast disease group.As for Her2 line detection,the sensitivity,specificity,and accuracy of PCR assay were higher than immunohistochemistry.ConclusionBoth immunohistochemistry and PCR can be used to for breast cancer susceptibility gene detection,and PCR detection has higher sensitivity,specificity,and accuracy.

Key words:Breast cancer; Immunohistochemistry; Polymerase chain reaction; Susceptibility gene; Evaluation

收稿日期：2015-06-08修回日期：2015-09-10編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.043

中圖分類號：R737;R446

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4343-03