劉 暢，路義鑫，楊朋欣，李曉云，王 澤，汪 洋，宋銘忻

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

豬囊尾蚴(Cysticercus cellulose)和華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)可以感染人和動物導(dǎo)致囊尾蚴病和華支睪吸蟲病[1]。腦囊尾蚴病是因中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染囊蟲而呈現(xiàn)出不同的臨床癥狀，包括癲癇癥和腦積水[2]；華支睪吸蟲病最常見表現(xiàn)為肝吸蟲病，嚴重者甚至發(fā)展為膽管癌[3]。最新寄生蟲血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國大陸豬囊尾蚴和華支睪吸蟲人群感染率分別為0.58 %和0.55 %[4]。由于現(xiàn)代人飲食來源和方式的多樣化，豬囊尾蚴和華支睪吸蟲等感染引起的食源性寄生蟲病造成的食品安全問題愈發(fā)突出，并且成混合感染趨勢[4-5]。因此，加強寄生蟲豬囊尾蚴和華支睪吸蟲的檢測尤為重要。

目前，寄生蟲的檢測方法主要是基于PCR 方法的分子生物學(xué)檢測手段，包括多重PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、PCR-RFLP 技術(shù)等[6-10]。液相基因芯片技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種結(jié)合Luminex xMAP(液相芯片)系統(tǒng)與多重PCR 技術(shù)的新型檢測手段，可以滿足高通量多指標同步、迅速和高效的檢測微生物的要求[11-12]。國內(nèi)鮮有關(guān)于液相基因芯片寄生蟲檢測的報道[13-14]，而同時檢測豬囊尾蚴和華支睪吸蟲兩種蟲體仍無相關(guān)報道。本研究以豬囊尾蚴ITS 基因和華支睪吸蟲ITS 基因為靶序列，設(shè)計并合成特異性探針和引物，擴增目的片段并構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒標準品，建立一種基于雙重PCR 的高效、靈敏和特異的液相基因芯片檢測方法。

1 材料和方法

1.1 蟲 株 豬囊尾蚴由蘭州獸醫(yī)研究所惠贈，為吉林省長春株；華支睪吸蟲由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲教研室惠贈，為黑龍江省肇源株；弓形蟲(T.gondii)由蘭州獸醫(yī)研究所惠贈，為GLS 株；豬旋毛蟲(T.spiralis)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲教研室保種，為黑龍江省五常株。

1.2 主要試劑及儀器 鏈霉素-親和素-藻紅蛋白(SAPE)、表面羧基化的熒光編碼微球購自上海透景生物科技有限公司；Luminex100液體懸浮點陣檢測儀為美國Luminex 公司產(chǎn)品。

1.3 探針及引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 登錄的豬囊尾蚴ITS1(EU747668)和華支睪吸蟲ITS1(EU038112)基因序列，分別選擇保守區(qū)域應(yīng)用DNA Star、Primer5.0 和Oligo6.0 軟件設(shè)計探針和引物(表1)。探針5'端均添加poly TⅡ尾并氨基化，同時將兩條用于雜交的生物素標記的探針互補鏈作為陽性對照，上游引物5'端均采用生物素標記。探針和引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 探針和引物序列Table 1 The sequences of the probes and primers

1.4 重組質(zhì)粒標準品的制備 分別以豬囊尾蚴和華支睪吸蟲基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增，同時設(shè)置陰性對照，反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s、57.5 ℃/59 ℃30 s、72 ℃45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后分別克隆于pMD18-T 載體中，測序鑒定。測定陽性重組質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式換算成質(zhì)?？截悢?shù)，作為重組質(zhì)粒標準品，將其進行2 倍倍比稀釋(20～2-11)。

1.5 雙重PCR擴增 以兩種蟲體混合基因組DNA為模板，進行雙重PCR 擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃45 s，30 個循環(huán)；72 ℃8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)6 % SDS-PAGE 電泳分離，銀染，拍照。

1.6 液相基因芯片檢測體系建立

1.6.1 探針與微球的偶聯(lián) 將豬囊尾蚴和華支睪吸蟲ITS1 基因探針分別與表面帶有活性羧基化基團編號為44 和56 號的微球偶聯(lián)，命名為Ⅰ和Ⅱ，整個偶聯(lián)過程由上海透景生物科技有限公司完成，并采用生物素標記的探針互補鏈分別測定偶聯(lián)率。

1.6.2 探針偶聯(lián)的驗證 分別取單項和雙重PCR 產(chǎn)物各3 μL，加入7 μL TE 溶液和20 μL 稀釋的微球溶液，95 ℃變性5 min，50 ℃孵育20 min，加入80 μL 顯色液，50 ℃孵育20 min，于Luminex100液體懸浮點陣檢測儀讀取各微球檢測的熒光強度值。

1.6.3 液相基因芯片結(jié)果判定標準 理論上只有當探針與相應(yīng)的DNA 模板特異性結(jié)合時才會產(chǎn)生熒光信號，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均熒光強度(Median Fluorescence Intensity，MFI)表示。信噪比SR=MFI(目標產(chǎn)物)/MFI(空白背景)，當SR≥3，并且滿足MFI(目標產(chǎn)物)>100，即判定目標產(chǎn)物為陽性[10]。

1.7 特異性試驗 采用建立的雙重PCR 方法分別擴增弓形蟲、旋毛蟲、豬囊尾蚴、華支睪吸蟲的基因組DNA 以及豬囊尾蚴和華支睪吸蟲的混合基因組DNA，應(yīng)用液相基因芯片體系檢測各基因組PCR 產(chǎn)物的熒光強度，并對結(jié)果進行分析，驗證該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 對豬囊尾蚴和華支睪吸蟲ITS1基因陽性重組質(zhì)粒標準品進行2-n倍比稀釋，各稀釋12 個梯度(20～2-11)，經(jīng)PCR 擴增，分別應(yīng)用液相基因芯片體系和瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較兩者的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗 采用PCR 方法分別擴增豬囊尾蚴和華支睪吸蟲的基因組DNA，以液相基因芯片體系檢測相應(yīng)PCR 產(chǎn)物熒光強度，在相同試驗條件下重復(fù)6 次，并對結(jié)果進行分析，驗證該方法的重復(fù)性。

1.10 人工模擬樣品檢測試驗 分別提取豬囊尾蚴、華支睪吸蟲和檢疫合格豬肌肉組織的基因組DNA，將各基因組DNA 分裝至30 個EP 管中：其中20 個管加入一種蟲體基因組DNA；8 個管加入兩種蟲體的混合基因組DNA；另外2 個管為對照組。將30 個EP 管隨機編號，應(yīng)用建立的液相基因芯片方法分別擴增，對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增與重組質(zhì)粒標準品的制備 分別以豬囊尾蚴和華支睪吸蟲基因組DNA 為模板，采用PCR 擴增得到大小約為150 bp 和170 bp 的目的片段(圖1)，與預(yù)期相符。將其分別克隆于pMD18-T 中構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品，測序結(jié)果表明，豬囊尾蚴和華支睪吸蟲ITS1 基因與GenBank 登錄的相應(yīng)基因片段相似性分別為99.35 %和98.27 %。

圖1 目的基因PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of C.cellulose and C.sinensis

2.2 雙重PCR擴增產(chǎn)物銀染結(jié)果 以豬囊尾蚴和華支睪吸蟲混合基因組DNA 為模板，進行雙重PCR 擴增，經(jīng)6 % SDS-PAGE 電泳分離，銀染結(jié)果顯示，目的片段與預(yù)期大小相符，并且其結(jié)果與單項PCR 一致(圖2)。

圖2 雙重PCR 擴增結(jié)果Fig.2 Optimization test of duplex PCR

2.3 液相基因芯片體系建立 應(yīng)用生物素標記的探針互補鏈測定液相基因芯片Ⅰ和Ⅱ，兩蟲體SR 分別為124.3 和189.05，表明檢測偶聯(lián)率較高，探針可以特異性的結(jié)合到微球上，液相基因芯片Ⅰ和Ⅱ可以用于該檢測體系。液相基因芯片體系檢測單項PCR 和雙重PCR 產(chǎn)物結(jié)果表明：陰性和陽性的熒光強度檢測值與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致(圖略)，目的產(chǎn)物SR 信噪比高，可視為陽性結(jié)果，雙重PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果與單重PCR 產(chǎn)物檢測結(jié)果一致(表2)。

2.4 特異性試驗 分別應(yīng)用建立的液相基因芯片體系Ⅰ和Ⅱ檢測弓形蟲、旋毛蟲、豬囊尾蚴、華支睪吸蟲PCR 產(chǎn)物以及豬囊尾蚴和華支睪吸蟲混合PCR產(chǎn)物的熒光強度。根據(jù)該檢測體系的判定標準，結(jié)果顯示，擴增豬囊尾蚴、華支睪吸蟲及二者混合DNA 的檢測結(jié)果為陽性，而擴增弓形蟲和旋毛蟲DNA 的結(jié)果為陰性，表明該方法具有較好的特異性(表3)。

表2 液相基因芯片檢測豬囊尾蚴和華支睪吸蟲Table 2 C.cellulose and C.sinensis detected by liquid gene chip

表3 液相基因芯片特異性檢測Table 3 Specificity tests of liquid gene chip

2.5 敏感性試驗 以豬囊尾蚴和華支睪吸蟲12 個梯度稀釋的陽性重組質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物通過液相基因芯片體系檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，前者檢測兩蟲體的最低檢出濃度均可達到原液的2-9，靈敏度分別為5.13×104拷貝/μL 和2.03×104拷貝/μL(圖3)；后者檢測兩蟲體的最低檢出濃度為原液的2-6和2-5，靈敏度分別為4.11×105拷貝/μL 和1.63×105拷貝/μL(圖4)，液相基因芯片體系的靈敏度約為瓊脂糖凝膠電泳的8 倍。

2.6 重復(fù)性檢測 在相同試驗條件下，液相基因芯片體系重復(fù)檢測樣品6 次，計算各批間的MFI 及變異系數(shù)(CV)。結(jié)果顯示各變異系數(shù)均在8 %以內(nèi)(表4)，表明重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.7 人工模擬樣品檢測試驗結(jié)果 應(yīng)用液相基因芯片體系檢測待檢樣品，30 份樣品中陽性率和陰性率分別為90%(27/30)和7%(2/30)，檢出率分別為96%和100 %，盲測與預(yù)期的結(jié)果基本相符，準確率達98 %，表明該方法在實際操作中具有一定的可行性。

圖3 液相基因芯片檢測豬囊尾蚴和華支睪吸蟲的敏感性結(jié)果Fig.3 Sensitivity tests of C.cellulose and C.sinensi by liquid gene chip

圖4 瓊脂凝膠檢測豬囊尾蚴和華支睪吸蟲敏感性結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of C.cellulose and C.sinensis by agarose gel

表4 液相基因芯片體系重復(fù)性檢測Table 4 Reproducibility test of liquid gene chip

3 討論

近年來，關(guān)于寄生蟲的分子生物學(xué)檢測方法發(fā)展迅速。本研究建立在Luminex xMAP(液相芯片)系統(tǒng)與雙重PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，形成的液相基因芯片體系充分結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點，可以實現(xiàn)同時對豬囊尾蚴和華支睪吸蟲的檢測。結(jié)果顯示該方法特異性強、靈敏性高、重復(fù)性好，其靈敏度分別高達5.13×104拷貝/μL 和2.03×104拷貝/μL，這與張媛和楊朋欣建立的液相芯片技術(shù)對旋毛蟲和弓形蟲等的檢測靈敏度屬于同一數(shù)量級[13-14]。與傳統(tǒng)的寄生蟲檢測和監(jiān)測技術(shù)如病原學(xué)檢測技術(shù)(目檢法、壓片鏡檢法、組織學(xué)診斷法)，免疫學(xué)檢測技術(shù)(間接血凝試驗、ELISA、雙抗體夾心)相比，該技術(shù)更具優(yōu)勢。

正確選擇靶基因和設(shè)計探針對液相基因芯片檢測體系的建立至關(guān)重要。大多數(shù)生物體中，核糖體基因的一級結(jié)構(gòu)高度保守和重復(fù)，作為重復(fù)單位的特殊組成部分ITS1，被廣泛應(yīng)用于寄生蟲的分類、鑒定和系統(tǒng)發(fā)育等研究[15-16]。本研究建立的液相基因芯片技術(shù)能夠特異地對豬囊尾蚴和華支睪吸蟲PCR 產(chǎn)物進行檢測，靈敏性檢測結(jié)果顯示MFI 值隨著PCR 產(chǎn)物濃度減少，呈先升高后下降的趨勢，該現(xiàn)象未見有相關(guān)文獻報道，推測可能是體系所限，液相基因芯片對PCR 產(chǎn)物濃度也有最適濃度。因所用蟲體均為人獸共患寄生蟲，考慮到安全性和可行性等因素，本研究采用人工模擬污染樣品試驗，雖然其盲測結(jié)果相對準確可靠，但在臨床樣品的檢測應(yīng)用有待下一步驗證?？傊?，本研究建立的液相基因芯片技術(shù)不僅為寄生蟲的檢驗檢疫和衛(wèi)生監(jiān)督提供一項新技術(shù)，也為未來這項技術(shù)在科學(xué)研究、臨床檢測、疾病的預(yù)防及早期診斷中的廣泛應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

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