陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東

( 廣州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室， 廣東 廣州 510182)

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·論著·

小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3甲基腺嘌呤的影響

陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東*

( 廣州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室， 廣東 廣州 510182)

目的:探討小鼠急性心肌梗死(AMI)后炎癥因子IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3-甲基腺嘌呤對心肌炎癥因子IL-1β和IL-6釋放的影響。方法：雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成四組：假手術(shù)組、AMI 1 d組、AMI 7 d組、AMI 21 d組，用超聲心動儀檢測心功能變化，用熒光定量PCR法、ELISA法和免疫組化法測量血清和心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化，用免疫蛋白印跡方法檢測心肌組織IL-1β轉(zhuǎn)換酶caspase-1蛋白的變化情況。在AMI 后給予3-甲基腺嘌呤7 d，用超聲心動儀檢測心功能變，用ELISA法和免疫組化法測量心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化情況。結(jié)果：小鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)后7、21 d心功能顯著下降。小鼠AMI 后炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA水平表達(dá)增加，在血清和心肌組織中蛋白含量增加(P<0.05)。小鼠AMI 后心肌中caspase-1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。3-甲基腺嘌呤加重小鼠AMI 7 d后心臟功能下降(P<0.05)，并促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-6的釋放(P<0.05)。結(jié)論：小鼠心肌損傷過程中炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)增加，其機(jī)制可能跟AMI 后caspase-1的增加有關(guān)；3-甲基腺嘌呤加重AMI 后心功能的下降，其機(jī)制可能與促進(jìn)炎癥因子釋放有關(guān)。

急性心肌梗死；3-甲基腺嘌呤；炎癥因子；白介素-1；白介素-6；半胱氨酸天冬氨酸酶-1

冠心病已成為人類死亡的首要原因，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的急危重癥。目前臨床廣泛的救治手段是在治療窗內(nèi)對閉塞的冠狀動脈進(jìn)行血運(yùn)重建，如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋術(shù)，但是缺血造成心肌細(xì)胞炎癥等損傷導(dǎo)致心臟功能下降仍然是AMI臨床治療的重要障礙[1]。各種誘因?qū)е碌难ㄐ纬勺钄喙诿}血流引發(fā)AMI后異常激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，致IL-1β、IL-6等促炎因子分泌增多，共同參與心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化等病理過程，成為導(dǎo)致心肌進(jìn)行性重構(gòu)、心功能惡化的重要原因[2]。半胱氨酸天冬氨酸酶 (caspase)-1是caspase超家族的重要成員，能夠?qū)L-1β前體切割為具有活性的IL-1β，活性的IL-1β可激活下游NF-κB信號通路，促進(jìn)IL-6等炎癥因子的釋放[3]，被認(rèn)為與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)。鑒于炎癥因子在AMI病程中扮演重要角色，本研究旨在觀察小鼠AMI后促炎因子的動態(tài)變化以及可能的相關(guān)機(jī)制，為臨床進(jìn)一步認(rèn)識AMI的病理生理過程提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性清潔級C57BL/6小鼠68只，體質(zhì)量 24～26 g，由廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證：SCXK 粵 2008-0002。

1.2 主要試劑

3-甲基腺嘌呤購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce。蛋白電泳分子量(10～170kDa) 標(biāo)記購自加拿大Fermentas。IL-1β抗體、IL-6抗體、caspase-1 抗體、GAPDH抗體、抗兔Ⅱ抗購自美國Santa Cruz。ELISA試劑盒購自深圳欣博盛。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara。SYBR?Green Ⅰ熒光定量試劑購自Roche。引物合成購自美國Invitrogen。其余試劑均為分析純產(chǎn)品。所用引物由美國Invitrogen公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 熒光定量PCR所用的引物

1.3 研究方法

1.3.1 分組 將小鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組(AMI 0d，n=10)：小鼠冠狀動脈左前降支(LAD)只穿線不結(jié)扎；AMI 1d組(n=16)：小鼠LAD進(jìn)行結(jié)扎；AMI 7d組(n=16)：小鼠LAD進(jìn)行結(jié)扎；AMI 21d組(n=16)：小鼠LAD進(jìn)行結(jié)扎；AMI 7d+3-甲基腺嘌呤組(AMI 7d+3MA組，n=9)：小鼠LAD進(jìn)行結(jié)扎后，給予3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]。

1.3.2 小鼠AMI模型的建立[4]連接心電圖，氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，正壓通氣，頻率為 150次/min，呼吸氣時(shí)比為5∶4，潮氣量約 1.5 mL/kg。于左胸第3～4肋間開胸，暴露心臟。在左心耳與肺動脈圓錐間，以左冠狀動脈主干為標(biāo)志，用8～0號縫線針穿刺結(jié)扎LAD。觀察心電圖，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn) ST 段抬高及肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域以下組織變白等心肌缺血表現(xiàn)確定為結(jié)扎成功的指標(biāo)；結(jié)扎確實(shí)后，膨肺，逐層關(guān)胸。

1.3.3 超聲測量心功能 實(shí)驗(yàn)結(jié)束進(jìn)行M型超聲心動圖檢測。采用加拿大Visual Sonics產(chǎn)的Vevo2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(RMV707B 探頭，頻率設(shè)置為23MHz或30 MHz，探測深度為10～15 mm)和連接高頻探頭西門子超聲儀。2%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定，左胸前化學(xué)脫毛膏脫毛，在胸廓表面涂抹超聲波導(dǎo)聲劑，探頭置于小鼠胸骨前，獲取胸骨旁長軸、短軸視野。左室短軸切面，于乳頭肌水平應(yīng)用M型超聲記錄左心室運(yùn)動曲線，測量左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑 (left ventricular internal dimension，diastolic；left ventricular internal dimension,systolic； LVIDd和LVIDs)，左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)。

1.3.4 熒光定量PCR法檢測IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá) 根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，樣本按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：總體積25 μL，其中SYBR?GreenⅠ12.5 μL，上游引物 F 0.5 μL，下游引物R 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，母版DNA1 μL。反應(yīng)條件為，95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.5 細(xì)胞因子的測定方法 用酶聯(lián)免疫方法測定心肌組織和血清IL-1β、IL-6水平。步驟如下：①除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔) 加入相應(yīng)孔中，用封板膠封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90 min，洗板； ② 除空白孔外，加入生物素抗體工作液(100 μL /孔) 封住板孔，36℃孵箱孵育60 min，洗板； ③加入酶結(jié)合物工作液(100 μL /孔) 封住板孔，36℃孵箱孵育30 min，洗板；④加入顯色劑(100 μL /孔)，36℃避光顯色15 min；⑤加入終止液(100 μL /孔)，混勻即刻測量A450 值； ⑥在手工繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上測出標(biāo)本的濃度。

1.3.6 免疫組織化學(xué) 用免疫組織化學(xué)方法測定心肌IL-1β、IL-6水平。標(biāo)本常規(guī)固定、 石蠟包埋后切片，免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌IL-1β、IL-6的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 小鼠AMI7、21d后心臟功能下降

本實(shí)驗(yàn)共準(zhǔn)備68只雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行AMI手術(shù)。根據(jù)小鼠LAD結(jié)扎前后心臟結(jié)扎區(qū)域心肌顏色的變化情況和心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段是否抬高來判斷手術(shù)是否成功?？傮w造模成功57只小鼠,成功率為83.82%。小鼠行LAD結(jié)扎1、7和21d后分別進(jìn)行超聲心功能檢測,結(jié)果顯示AMI7、21d后小鼠心功能下降(P<0.05)，見圖1。

2.2 小鼠AMI1、7和21d后心肌IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)增加

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速取AMI周邊區(qū)于提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示AMI1、7和21d后小鼠心臟組織IL-1βmRNA表達(dá)增加，而IL-6mRNA表達(dá)在AMI1d達(dá)到峰值，隨后下降，但與正常組相比仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖2。

注：A：M-模式圖典型代表團(tuán)；B：左心室收縮末內(nèi)徑、左心室舒張末內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率的統(tǒng)計(jì)分析；與假手術(shù)組比較，*P<0.05

圖1 小鼠AMI后心臟功能變化情況

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

圖2 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的mRNA水平

2.3 小鼠AMI 1、7 d后心肌和血清中IL-1β和IL-6表達(dá)增加

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉小鼠行主動脈取血并迅速取AMI周邊區(qū)進(jìn)行ELISA法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示AMI 1、7d后小鼠心臟組織和血清中IL-1β和IL-6表達(dá)增加(P<0.05)，見圖3。

2.4 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌IL-1β和IL-6 免疫組化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速取心臟固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋切片后進(jìn)行免疫組化法檢測，結(jié)果顯示AMI 1、7、21 d后小鼠心臟組織IL-1β和IL-6表達(dá)增加。見圖4

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

圖3 小鼠AMI后心肌和血清IL-1β和IL-6的含量

圖4 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的表達(dá)變化情況(×400)

2.5 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌caspase-1蛋白表達(dá)增加

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速取AMI周邊區(qū)提取蛋白進(jìn)行蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示AMI 1、7 d后小鼠心臟組織活化的caspase-1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖5。2.6 小鼠AMI后給予3-甲基腺嘌呤后心功能下降，心肌細(xì)胞IL-1β和IL-6的表達(dá)增加

C57BL/6小鼠進(jìn)行AMI手術(shù)后即腹腔注射3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]，給藥7 d后進(jìn)行進(jìn)行超聲心功能檢測, 結(jié)果顯示，與AMI 7d組相比，給予3-甲基腺嘌呤7 d后小鼠心功能下降，LVIDs增加，EF、FS下降(P<0.05)，心肌細(xì)胞IL-1β和IL-6的表達(dá)增加(P<0.05)，見圖6，7。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

圖5 小鼠AMI后心肌活化的caspase-1蛋白的表達(dá)情況

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

圖6 小鼠AMI并注射3-甲基腺嘌呤7 d后心臟功能變化情況

注：與AMI 7 d組比較，*P<0.05

圖7 3-甲基腺嘌呤促進(jìn)小鼠AMI 7 d后心肌IL-1β和IL-6的表達(dá)

3 討 論

心肌缺血是威脅人類健康的常見心血管疾病。明確AMI的發(fā)病機(jī)制對于臨床治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5-6]。AMI的基本病因是冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂、出血和血栓的形成，造成管腔嚴(yán)重狹窄或閉塞引起心肌血供不足或中斷[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著小鼠LAD結(jié)扎時(shí)間的增長，心臟功能逐漸下降。AMI后心輸出量的急劇減少引起機(jī)體和各組織器官血供減少，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境失衡，產(chǎn)生大量自由基激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使 IL -1β、IL -6等炎癥因子水平升高，并引起反應(yīng)逐級放大，引起炎癥反應(yīng)綜合征、加重心肌組織缺氧、功能障礙[9]。

Yuan等[10]在1993年發(fā)現(xiàn)IL-1β轉(zhuǎn)換酶(IL -1β converting enzyme, ICE)與秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的死亡基因CED-3具有高度同源性，過表達(dá)該基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，于是ICE后來被重新命名為caspase-1，故caspase-1也可以被稱為IL -1β轉(zhuǎn)換酶。caspase-1是以無活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在于細(xì)胞質(zhì)中，其分子量為45 kDa，其活化需要炎性平臺[11]。當(dāng)機(jī)體受到各種病原體或其他刺激時(shí)細(xì)胞內(nèi)會生成炎性體，該炎性體可以募集pro-caspase-1并形成相對局部高濃度，此時(shí)酶原自體水解，形成具有活性的caspase-1，后者通過促進(jìn)炎癥因子IL-1β的加工和釋放而調(diào)控細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[3]。IL-1β是細(xì)胞內(nèi)重要的促炎癥因子，與相應(yīng)受體結(jié)合而激活下游的NF-κB信號通路，促進(jìn)如IL-3、IL-5、IL-6等炎癥因子的釋放。

本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期(AMI 1d)和亞急性期(AMI 7d)心肌炎癥因子IL -1β、IL -6的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，釋放入血清中的炎癥因子IL -1β、IL -6也增加，但是在修復(fù)期(AMI 21d) 時(shí)IL -1β、IL -6的表達(dá)又明顯下降了，表明炎癥因子IL -1β、IL -6參與了AMI急性期和亞急性期的病理生理進(jìn)展過程，而在修復(fù)期時(shí)炎癥對心肌重構(gòu)的作用就減弱了。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期和亞急性期心肌caspase-1前體表達(dá)下降，而有活性的caspase-1表達(dá)增加，而在修復(fù)期時(shí)活化的caspase-1表達(dá)減少。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠AMI后心臟活性caspase-1的表達(dá)與炎癥因子IL -1β、IL -6的表達(dá)具有一定的同步性，那么AMI后炎癥因子IL -1β、IL -6的增加與caspase-1信號通路的變化是否具有一定的因果關(guān)系，尚需進(jìn)一步的研究探討。

本研究發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤可以促使AMI后心臟功能的進(jìn)一步惡化，同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)，但是其機(jī)制尚不清楚。很多文獻(xiàn)報(bào)道3-甲基腺嘌呤可抑制自噬的水平[12]，有研究3-甲基腺嘌呤可以抑制III型PI3K或干擾Bcl-2和Beclin-1的表達(dá)[13]，發(fā)現(xiàn)因此3-甲基腺嘌呤加AMI后心功能的惡化，有可能與抑制自噬途徑有關(guān)，需要進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)研究探討。

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(本文編輯:王馨)

·醫(yī)學(xué)新聞·

前列腺癌：非手術(shù)方法治療效果或許更好

據(jù)生物谷報(bào)道，一項(xiàng)由美國約翰霍普金斯大學(xué)Brady泌尿研究所完成的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明，對于成年男性中那些非侵略性前列腺癌患者和由泌尿?qū)＜冶O(jiān)控病情的前列腺癌患者，其發(fā)展成為惡性前列腺癌的概率和死于癌癥的概率很低。這項(xiàng)研究分析了過去20年間，1298位參與“前列腺癌主動監(jiān)控”項(xiàng)目的成年男性患者中，僅有兩位死于前列腺癌和三位發(fā)展為了惡性前列腺癌。

這項(xiàng)研究的領(lǐng)導(dǎo)者、成年泌尿?qū)？浦魅蜨. Ballentine Carter教授指出，通過他們的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，那些只患有非侵略性前列腺癌和長期處于醫(yī)生監(jiān)控監(jiān)控下的前列腺癌患者們的死亡率很低。雖然說，這個(gè)“前列腺癌主動監(jiān)控”項(xiàng)目的患者有的是被“精心選擇”過的，但是如果繼續(xù)這項(xiàng)研究，Carter教授認(rèn)為結(jié)果也不會有太大變化。原因在于，三位死者中的兩位的死亡另有其他原因。同時(shí)，Carter教授也指出，這項(xiàng)研究是在高加索人種(白人)中完成的，可能并不適用于黑人，因?yàn)楹谌说陌┌Y往往為惡性癌癥。

Effect of 3-methyl adenine on dynamic changes of IL-1β and IL-6 in mice with acute myocardial infarction

ChenFajiang,HeLishan,LiKanglan,YangYa,LuoJiandong

(DepartmentofPharmacology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

Objective:To investigate the dynamic changes of the inflammatory cytokines, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in mice after acute myocardial infarction (AMI) and the effect of 3-methyl adenine on the release of myocardial inflammatory cytokines IL-1β and IL-6.Methods:Male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:sham operation group, AMI 1 day (AMI 1d) group, AMI 7 days (AMI 7d) group, and AMI 21 days (AMI 21d) group. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in serum and myocardial tissue by fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, and IL-1β converting enzyme caspase-1 protein in myocardial tissue by Western blotting. All mice were given 3-methyl adenine for seven days after AMI. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in myocardial tissue by ELISA and immunohistochemistry. Results: The heart function in mice was significantly decreased at 7 and 21 d after left anterior descending coronary artery ligation. Increased mRNA expression levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6, and increased protein levels in serum and myocardial tissue were found in mice after AMI (P<0.05). The caspase-1 protein expression was increased in myocardial tissue in mice after AMI (P<0.05). 3-methyl adenine aggravated heart dysfunction in the AMI 7d group (P<0.05), and promoted the release of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 (P<0.05). Conclusion:In the process of myocardial injury, inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 expression are increased in mice. The mechanism may be associated with the increased caspase-1 after AMI. 3-methyl adenine aggravates heart dysfunction in mice after AMI, probably via the release of inflammatory cytokines.

acute myocardial infarction; 3-methyl adenine; inflammatory factor; interleukin-1;interleukin-6; caspase-1

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173062)

陳法江(1989-)，男，碩士，助理研究員。

R363

2095-9664(2015)05-0006-06

2014-07-24)

研究方向：心血管藥理學(xué)。

*通訊作者:E-mail:jiandongluo@hotmail.com