張棟棟，付亞杰，陳小蕓，魯永婷，范 維，郭鈺珍

（1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)專業(yè) 730000；2.山東省桓臺(tái)縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科256400；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦科 730000；4.山東省淄博市婦幼保健院 255000）

異甘草素 （isoliquiritigenin，ISL）是一種黃酮類化合物，是甘草中重要的活性成分之一，具有多種藥理活性，諸如抗腫瘤、抗病毒、抗自由基、松弛血管、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等。其中抗腫瘤作用是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1-3]。研究證明ISL對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的體外抑制作用，但對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)初步觀察ISL對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖的影響，探討其可能的抗腫瘤的作用機(jī)制，為ISL的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；ISL為天津馬克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品[高效液相色譜法（HPLC）≥98%，批號(hào)：GC-20120203]；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FITC／PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Beclin1抗體、兔抗人LC3抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology（CST）公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，以1×104個(gè)／孔加入96孔板，待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，試驗(yàn)組分別加入不同濃度的ISL，使其終濃度分別為5、10、20 μg／mL，陰性對(duì)照組加入0.01%的DMSO，空白對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)6、12、24、48h后，每孔加入20μL濃度為5 mg／mL的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，然后每孔再加入150μL DMSO，振蕩3min，使結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀于490nm處檢測(cè)吸光度A值，以A490nm值的大小反映活細(xì)胞的多少。細(xì)胞抑制率＝（1-試驗(yàn)組A值／空白對(duì)照組A值）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 倒置光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度ISL（0、5、10、20μg／mL）作用48h后，SKOV3形態(tài)學(xué)變化。吖啶橙／溴化乙錠雙熒光染色后，再次觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并拍照。

1.2.4 Annexin V FITC／PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集不同濃度ISL（0、5、10、20μg／mL）作用48h后的細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，收集細(xì)胞，1 500r／min離心5min，棄上清液，PBS洗2遍（1 500r／min離心5min）。500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V FITC和5μL PI，混勻后避光孵育5min，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，以1×105個(gè)／孔接種于6孔板，24h細(xì)胞貼壁后換液，加入不同濃度的ISL，使其終濃度分別為0、5、10、20μg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄上清液，PBS清洗3遍，用干凈濾紙吸凈PBS，RIPA（含cocktail）裂解液冰上裂解細(xì)胞提取蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA法蛋白定量，蛋白變性，十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，50g／L脫脂奶封閉2h，分別加入一抗Bcl-2、Bax、GAPDH、Beclin1、LC3[均為兔抗原，50g／L 牛血清清蛋白（BSA）1∶1 000稀釋]，4℃條件下孵育過(guò)夜，洗膜，二抗（1∶5 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔）孵育1h，洗膜，滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光劑，暗盒曝光顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 各加藥組細(xì)胞經(jīng)ISL分別作用6、12、24、48h后，光鏡下均可見(jiàn)細(xì)胞皺縮變圓，體積縮小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多顆粒、空泡，胞核不清，細(xì)胞脫壁浮起并出現(xiàn)片狀無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)，幾乎無(wú)脫落，細(xì)胞完整，胞質(zhì)飽滿，胞核清晰圓潤(rùn)，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片，可見(jiàn)核分裂相。48hISL 20μg／mL組，吖啶橙／溴化乙啶雙染后在熒光顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組活細(xì)胞，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀；晚期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀，如圖1所示。

圖1 吖啶橙／溴化乙啶雙染后觀察SKOV3細(xì)胞的形態(tài)改變（×200）

2.2 ISL對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外增殖的抑制作用 5、10、20μg／mL的ISL對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞均有明顯抑制作用，且隨著ISL濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用明顯增強(qiáng)。20μg／mL的ISL作用48h，對(duì)細(xì)胞的抑制率可達(dá)68.07%，見(jiàn)表1。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的A490nm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示0.01%DMSO對(duì)SKOV3細(xì)胞無(wú)抑制作用。

表1 ISL對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表1 ISL對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與ISL 0μg／mL組比較。

抑制率（%）組別6h 12h 24h 48h ISL 0μg／mL組0.27±1.16-0.68±1.52 1.16±2.06 1.59±1.31 ISL 5μg／mL組 5.32±3.93a7.19±3.86a12.32±4.99a28.48±5.07a ISL 10μg／mL組 6.77±3.52a18.42±4.37a28.01±5.04a47.95±6.31a ISL 20μg／mL組 19.37±4.28a24.92±5.06a37.56±5.86a68.07±6.17a

2.3 Annexin V FITC／PI雙標(biāo)染色流式細(xì)胞儀分析ISL對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V FITC／PI雙標(biāo)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度ISL作用于SKOV3細(xì)胞48h后凋亡率變化，結(jié)果顯示ISL（5、10、20μg／mL）作用于SKOV3細(xì)胞48h后，凋亡率明顯高于ISL 0μg／mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨ISL濃度增加細(xì)胞凋亡率明顯增高。

2.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)變化 ISL作用于SKOV3細(xì)胞48h后，提取蛋白，Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax及Beclin1、LC3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISL處理細(xì)胞后，隨著濃度的增加，Bax、Beclin1、LC3的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)下降，ISL 5、10、20μg／mL組分別與0μg／mL組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 ISL作用于SKOV3細(xì)胞株后Bax、Bcl-2、LC3、Beclin1蛋白水平變化

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一。在美國(guó)，上皮性卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤，每年大約有22 000例新發(fā)病例和16 000例死亡病例[4-6]。我國(guó)發(fā)病患者數(shù)逐年遞增。由于卵巢位于盆腔深部，早期癥狀不明顯，同時(shí)缺乏可靠的篩選方法，大多數(shù)患者在就診時(shí)已到了晚期，治愈率很低[4-6]。目前對(duì)于卵巢癌主要的處理方法是外科手術(shù)，輔以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。盡管臨床常用化療藥物抗腫瘤的作用比較明確，但存在著不良反應(yīng)大，長(zhǎng)期應(yīng)用產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。很多病例多因鉑類化療藥耐藥性的產(chǎn)生而導(dǎo)致治療失敗、癌癥復(fù)發(fā)，故5年生存率僅30%～45%[4]。因此，尋找新的療效好、不良反應(yīng)小的化療藥物成為近年的研究熱點(diǎn)。而中藥因?yàn)榫哂胁涣挤磻?yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)受到人們的關(guān)注，其中黃酮類化合物的抗腫瘤作用成為近年的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究表明，黃酮類化合物能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。ISL作為一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性，其中抗腫瘤作用備受關(guān)注。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ISL可使SKOV3細(xì)胞增殖受到明顯抑制，具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。同時(shí)ISL可使SKOV3細(xì)胞凋亡率增加，隨著藥物濃度增高，細(xì)胞凋亡率增加更為顯著。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也顯示細(xì)胞發(fā)生凋亡改變，提示凋亡可能是ISL抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一。

關(guān)于凋亡機(jī)制的研究，可以通過(guò)檢測(cè)死亡受體通路的相關(guān)蛋白或基因（如：Fas）的表達(dá)[7]，也可以通過(guò)檢測(cè)線粒體凋亡途徑的相關(guān)蛋白或基因（如：Bcl-2、Bax）的表達(dá)，亦可以檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)，以進(jìn)一步明確其促凋亡的機(jī)制[8-9]。本研究分析ISL處理后對(duì)常見(jiàn)的促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)Bax的蛋白水平，降低Bcl-2的蛋白水平，表明ISL可激活SKOV3細(xì)胞的死亡受體途徑。本研究結(jié)果顯示ISL可以促進(jìn)SKOV3的自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)，隨著藥物濃度的增加，其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，同時(shí)SKOV3的凋亡率也增加。提示ISL可以促進(jìn)SKOV3自噬活性，從而使其凋亡。自噬現(xiàn)象最初被認(rèn)為是細(xì)胞的另外一種凋亡方式，目前研究表明，自噬可以維持細(xì)胞新陳代謝，但是當(dāng)自噬過(guò)度活躍時(shí)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬性凋亡[10-11]。凋亡和自噬都可以誘發(fā)細(xì)胞的程序性死亡，但是二者的關(guān)系仍不明確，但二者在某些情況下可以相互拮抗或促進(jìn)[12]。自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用不盡相同[13-14]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ISL具有毒性低、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)[3]，為臨床治人卵巢癌提供了更廣闊的思路，有著更卓越的臨床應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)為今后進(jìn)一步研究ISL的抑瘤機(jī)制和探索開(kāi)發(fā)人卵巢癌新的藥物治療提供了初步的試驗(yàn)依據(jù)。

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