秦樹森，楊 柯，曾春暉，譚娥玉，蔡妮娜，陳益清，顏 欣，徐明光

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)桂林市婦女兒童醫(yī)院藥劑科 541001）

飛機草（Eupatorium odoratum L）性微辛、溫，有小毒，具有散瘀消腫，止血，殺蟲功能，民間主要用于治療跌打腫痛，外傷出血，瘡瘍腫毒等[1]。在2003年國家環(huán)境保護(hù)局公布危害我國最嚴(yán)重的16種外來入侵物種中，飛機草危害程度名列第7位，這在一定程度上反映飛機草植物資源具有異常豐富的特點。前期研究也表明飛機草對冰醋酸和熱致痛有明顯鎮(zhèn)痛作用[2]。本文對其鎮(zhèn)痛部位及其可能的作用機制進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 2011年8月于南寧市郊采集飛機草，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教研室冼寒梅教授鑒定為菊科植物飛機草的地上部分。鹽酸哌替啶（湖北宜昌制藥廠）；阿司匹林（石家莊永強制藥廠）；納絡(luò)酮（北京四環(huán)制藥廠）；青霉素[中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司]；鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；冰醋酸（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；前列腺素E2（PGE2）試劑盒和NO試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器 全波長酶標(biāo)儀（Epoch Biotek公司，美國）；超聲勻漿器（寧波新芝科技研究所）；TGL-16B型高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；YLS-6B智能熱板儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；WSZ-261-79恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械一廠）；秒表（上海禾汽玻璃儀器有限公司）

1.1.3 實驗動物 昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量22～26g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物證號SCXK（桂）2009-0003。

1.2 方法

1.2.1 受試藥物制備 采集新鮮飛機草地上部分，洗凈，陰干，水提取2次。第1次10倍量水，提取1h，過濾。第2次8倍量水，提取0.5h，過濾，合并濾液，適當(dāng)濃縮，醇沉過夜，抽濾后濃度為5g／mL，4℃冰箱放置備用。

1.2.2 脊髓化小鼠甩尾實驗[3-4]

1.2.2.1 動物篩選 取昆明種小鼠150只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，篩選前在小鼠鼠尾尖部2cm處標(biāo)記，將這一部位尾端浸入50℃溫水浴中進(jìn)行藥前痛閾值測試和篩選，以鼠尾回縮出水面的時間為測痛指標(biāo)，剔除痛閾值小于3s，大于15s的小鼠。

1.2.2.2 脊髓化小鼠制備 挑選正常痛閾值合格的120只小鼠，用0.4%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，于胸椎6～8處剪開皮膚分離組織，除去椎板，暴露出脊髓后切除約1mm脊髓，隨即縫合皮膚，術(shù)后給予適量抗菌藥物抗感染。脊髓化合格的要求是小鼠無感染且后肢無爬行行為。

1.2.2.3 正式實驗 挑選合格的脊髓化小鼠90只，按脊髓化手術(shù)前測得的痛閾值隨機均分為6組，每組15只，即空白對照組（蒸餾水）、模型對照組（蒸餾水），陽性對照組（阿司匹林200 mg／kg）、飛機草高、中、低劑量組（40、20、10g／kg），灌胃，給予相應(yīng)藥物，1次／天，連續(xù)給藥3d，給藥容量20mL／kg，空白對照組、模型對照組給予等量蒸餾水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12h，末次給藥后1h，在小鼠鼠尾尖部2cm處標(biāo)記，將這一部位尾端浸入50℃溫水浴中，以鼠尾回縮出水面的時間作為測痛指標(biāo)。

1.2.3 福爾馬林致炎性疼痛實驗[5]取昆明種小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，隨機分為6組，即模型對照組（蒸餾水）、陽性對照組Ⅰ（鹽酸哌替啶40mg／kg）、陽性對照組Ⅱ（阿司匹林200mg／kg），飛機草高、中、低劑量組（40、20、10g／kg），每組10只，給予相應(yīng)藥物，給藥容量20mL／kg，1次／天，連續(xù)給藥3d，模型對照組給予等量的蒸餾水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12h，末次給藥后1h，于各組小鼠左后肢足跖部皮下注射1%的福爾馬林溶液10μL／只后，立即置入懸掛于鐵支架上的5 000mL的燒杯內(nèi)，通過燒杯下方傾斜30°鏡面觀察大鼠足部的反應(yīng)，分別觀察記錄注射0～10min（早期相）及10～30min（晚期相）的疼痛反應(yīng)評分，3分：舔、咬、抖足；2分：提足；1分：跛行；0分：行走自如。按下列公式計算各組疼痛反應(yīng)積分：疼痛反應(yīng)積分＝（0t1＋1t2＋2t3＋3t4）／（t1＋t2＋t3＋t4），t1、t2、t3、t4分別為0、1、2、3分時持續(xù)的時間（s），數(shù)據(jù)做統(tǒng)計 學(xué)處理。

1.2.4 納洛酮阻斷實驗[3，6]

1.2.4.1 冰醋酸扭體實驗 取昆明種小鼠90只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，隨機分為6組，即模型對照組（蒸餾水）、陰性對照組（納絡(luò)酮5mg／kg）、陽性對照組（鹽酸哌替啶40mg／kg）、飛機草高、中、低劑量（40、20、10g／kg）組，每組15只，給予相應(yīng)藥物，給藥容量20mL／kg，1次／天，連續(xù)給藥3d，模型對照組和陰性對照組給予等量的蒸餾水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12h，末次給藥后1h，除模型對照組小鼠皮下注射生理鹽水外，其余各組小鼠皮下注射納絡(luò)酮（5mg／kg），30min后，各組小鼠腹腔注射新鮮配制的0.6%冰醋酸溶液0.2mL／只，觀察小鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)，表現(xiàn)為腹部凹陷，軀干后腿伸直，臀部高起，并記錄15min內(nèi)扭體次數(shù)，數(shù)據(jù)做統(tǒng)計學(xué)處理，并按以下公式計算鎮(zhèn)痛率。鎮(zhèn)痛率%＝[（模型對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）／模型對照組扭體次數(shù)]×100%。

1.2.4.2 熱板法實驗

1.2.4.2.1 動物篩選 取昆明種小鼠110只，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，于（55.0±0.5）℃YLS-6B智能熱板儀的金屬板上，測定小鼠自放在金屬板上至出現(xiàn)舔后足所需時間（s）作為該鼠的基礎(chǔ)痛閾值，舔足時間小于5s或大于30s或跳躍者視為不合格，排除參加實驗。

1.2.4.2.2 正式實驗 將篩選合格的90只小鼠按基礎(chǔ)痛閾值隨機、均分為6組，每組15只，即空白對照組（蒸餾水）、陰性對照組（納洛酮5mg／kg）、陽性對照組（鹽酸哌替啶40mg／kg）、飛機草高、中、低劑量組（40、20、10g／kg），間隔30 min測其正常痛閾值2次，取2次正常痛閾值的平均值為其正常痛閾值，然后給予相應(yīng)藥物，1次／天，給藥容量為20mL／kg，連續(xù)給藥3d，空白對照組和陰性對照組給予等量蒸餾水，末次給藥前12h禁食不禁水，于末次給藥后30min，除空白對照組小鼠皮下注射生理鹽水外，其余各組小鼠皮下注射納絡(luò)酮（5mg／kg），30min后，將小鼠放在（55.0±0.5）℃ YLS-6B智能熱板儀的恒溫金屬板上，分別記錄其第1次舔后足的時間，作為其痛閾值，數(shù)據(jù)做統(tǒng)計學(xué)處理。

1.3 對福爾馬林致炎性疼痛小鼠血清和腦組織中NO和PGE2含量的影響

1.3.1 測試樣品制備 取昆明種小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，隨機分為6組，即空白對照組（蒸餾水）、模型對照組（蒸餾水）、陽性對照組（阿司匹林200mg／kg）、飛機草高、中、低劑量組（40、20、10g／kg），每組10只，給予相應(yīng)藥物，給藥容量20mL／kg，1次／天，連續(xù)給藥3d，空白對照組和模型對照組給予等量的蒸餾水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12h，末次給藥后1h，于小鼠左后肢足跖部皮下注射1%的福爾馬林溶液10μL／只30min后，快速摘小鼠眼球取血，分離血清備測；同時處死小鼠，取全腦組織稱質(zhì)量，加入適量生理鹽水制成10%腦組織勻漿液，3 000r／min離心10min，取上清液備測。將血清和腦組織勻漿上清液置-20℃冰箱中保存，待測NO和PGE2含量。

1.3.2 小鼠腦組織和血清中NO、PGE2含量測定 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值，最終濃度＝實際測定濃度×稀釋倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)理，計量資料以±s表示，兩組間均數(shù)差異用t檢驗（方差不齊時采用t檢驗校正公式），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓化小鼠甩尾實驗 50℃溫水浴條件下，模型對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與飛機草高劑量組和陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 飛機草對小鼠脊髓化甩尾痛閾值的影響（±s）

表1 飛機草對小鼠脊髓化甩尾痛閾值的影響（±s）

-：無數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，與模型對照組比較。

組別 n 劑量（g／kg） 藥后痛閾值（s）空白對照組15 - 18.52±8.53模型對照組 15 - 20.02±12.57陽性對照組 15 0.2 34.56±16.42a飛機草高劑量組 15 40 31.52±14.14a飛機草中劑量組 15 20 26.53±12.44飛機草低劑量組15 10 28.27±15.47

2.2 福爾馬林致炎性疼痛實驗 在0～10min（早期相）內(nèi)，飛機草高、中劑量組，陽性對照組Ⅰ能明顯提高小鼠痛閾，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在10～30min（晚期相）內(nèi)，飛機草高、中劑量組，陽性對照組Ⅰ、Ⅱ均能明顯提高小鼠痛閾，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 納洛酮阻斷的冰醋酸扭體實驗 與模型對照組比較，納洛酮對冰醋酸所致扭體反應(yīng)無明顯影響（P＞0.05）；在納洛酮預(yù)處理情況下，鹽酸哌替啶鎮(zhèn)痛作用被阻斷，對冰醋酸所致扭體反應(yīng)次數(shù)無明顯減少（P＞0.05）；飛機草高、中劑量仍能顯著減少冰醋酸所致扭體反應(yīng)次數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.4 納洛酮阻斷的熱板實驗 在約55℃熱板條件下，與空白對照組比較，納洛酮對熱刺激所致疼痛無明顯影響（P＞0.05）；在納洛酮預(yù)處理情況下，鹽酸哌替啶鎮(zhèn)痛作用被阻斷，對熱刺激所致疼痛無明顯影響（P＞0.05）；飛機草高、中劑量仍能顯著延長小鼠舔后足的時間（P＜0.05），見表4。

表2 飛機草對由福爾馬林致炎小鼠痛閾的影響（±s）

表2 飛機草對由福爾馬林致炎小鼠痛閾的影響（±s）

-：無數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 n 劑量（g／kg）疼痛反應(yīng)積分（分）30min模型對照組0～10min 10～10 - 1.47±0.36 3.74±0.43陽性對照組Ⅰ 10 0.04 0.75±0.43b 3.22±0.33a陽性對照組Ⅱ 10 0.2 1.38±0.46 3.18±0.64a飛機草高劑量組 10 40 0.83±0.42b 3.07±0.73a飛機草中劑量組 10 20 1.02±0.41a3.23±0.58a飛機草低劑量組10 10 1.23±0.513 3.35±0.43

表3 飛機草對納洛酮阻斷的小鼠冰醋酸扭體反應(yīng)次數(shù)的影響（±s）

表3 飛機草對納洛酮阻斷的小鼠冰醋酸扭體反應(yīng)次數(shù)的影響（±s）

-：無數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，與模型對照組比較。

組別 n 劑量（g／kg）扭體次數(shù)（次／15min）鎮(zhèn)痛率（%）模型對照組15 - 46.00±27.51 -陽性對照組 15 0.04 43.00±21.98 6.52陰性對照組 15 0.005 42.00±24.75 8.70飛機草高劑量組 15 40 26.00±18.31a43.48飛機草中劑量組 15 20 28.00±17.20a39.13飛機草低劑量組15 10 41.00±20.34 10.87

表4 飛機草對納洛酮阻斷的小鼠熱板痛閾值的影響（±s）

表4 飛機草對納洛酮阻斷的小鼠熱板痛閾值的影響（±s）

-：無數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，與空白對照組比較。

組別 n 劑量（g／kg） 藥后痛閾值（s）空白對照組15 - 12.34±8.02陽性對照組 15 0.04 13.84±12.14陰性對照組 15 0.005 13.12±6.01飛機草高劑量組 15 40 23.88±16.69a飛機草中劑量組 15 20 21.52±12.51a飛機草低劑量組15 10 14.21±10.36

表5 對福爾馬林致炎疼痛小鼠腦組織和血清中NO含量的影響（±s）

表5 對福爾馬林致炎疼痛小鼠腦組織和血清中NO含量的影響（±s）

-：無數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 n 劑量（g／kg）腦組織NO含量（μmol／g）血清NO含量（μmol／L）空白對照組 10 - 3.08±1.15b 0.78±0.24b 10 10 8.18±2.93 2.33±1.19模型對照組 10 - 9.53±6.19 2.95±1.63陽性對照組 10 0.2 4.85±2.42a 1.67±0.91a飛機草高劑量組 10 40 4.39±1.69a 1.51±0.75a飛機草中劑量組 10 20 4.73±2.95a 1.71±0.65a飛機草低劑量組

2.5 對福爾馬林致炎疼痛小鼠腦組織和血清中NO含量測定 與空白對照組比較，模型對照組小鼠腦組織和血清中的NO含量顯著增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，陽性對照組、飛機草高、中劑量組小鼠腦組織和血清中的NO含量明顯降低（P＜0.05），見表5。

2.6 對福爾馬林致炎疼痛小鼠腦組織和血清中PGE2含量測定 與空白對照組比較，模型對照組小鼠腦組織和血清中的PGE2含量顯著增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，陽性對照組、飛機草高、中劑量組小鼠腦組織和血清中的PGE2含量明顯降低（P＜0.05），見表6。

表6 對福爾馬林致炎疼痛小鼠腦組織和血清中PGE2含量的影響（±s）

表6 對福爾馬林致炎疼痛小鼠腦組織和血清中PGE2含量的影響（±s）

-：無數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 n 劑量（g／kg）腦組織PGE2含量（pg／L）血清PGE2含量（pg／L）空白對照組 10 - 34.07±11.05b 36.70±13.47b模型對照組 10 - 265.18±156.10 270.10±158.99陽性對照組 10 0.2 142.66±68.07a150.40±71.25a飛機草高劑量組 10 40 139.23±65.84a142.10±73.10a飛機草中劑量組 10 20 141.77±71.77a144.40±95.30a飛機草低劑量組10 10 242.56±91.86 216.50±85.17

3 討 論

利用脊髓化動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)分離的特點，觀察動物在50℃溫水浴中的甩尾反應(yīng)來反應(yīng)藥物是否存在外周鎮(zhèn)痛效果，結(jié)果顯示飛機草能明顯延長小鼠甩尾時間；納絡(luò)酮可完全拮抗阿片受體激動藥的鎮(zhèn)痛作用[7-8]。納洛酮阻斷后，飛機草仍能明顯減少冰醋酸性炎癥疼痛致扭體反應(yīng)次數(shù)，對熱致痛也有明顯提高藥后痛閾值，延長小鼠舔后足的時間作用，以上結(jié)果均表明飛機草有明顯的外周鎮(zhèn)痛作用。

福爾馬林致炎性疼痛模型是目前公認(rèn)的一種較好的研究藥物鎮(zhèn)痛作用的模型[9]，其致痛分為2個時相，Ⅰ相（早期相）是由于福爾馬林直接刺激外周神經(jīng)末梢所致，Ⅱ 相（晚期相）則主要為炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、釋放引起[10-11]。麻醉性鎮(zhèn)痛藥如鹽酸哌替啶等對2個時相疼痛均有抑制，而外周鎮(zhèn)痛藥如阿司匹林等藥只能抑制Ⅱ相疼痛。實驗結(jié)果顯示飛機草高、中劑量對Ⅰ、Ⅱ相疼痛均有明顯抑制作用，表明飛機草除了外周鎮(zhèn)痛作用外，還具有一定的中樞鎮(zhèn)痛作用。

目前認(rèn)為疼痛與PGE2和NO有密切關(guān)系。PGE2的外周致痛作用早已明確，近年來越來越多的研究資料表明中樞產(chǎn)生的PGE2在痛覺傳遞過程中也起重要作用[12-13]。NO是一種信息傳遞物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，以不同水平在外周和中樞中參與痛覺的調(diào)節(jié)。同時，NO可促進(jìn)疼痛傳入和致痛介質(zhì)的釋放，并促進(jìn)脊髓痛覺過敏形成和腦內(nèi)痛覺信息的加工[14-15]。本研究結(jié)果表明，飛機草對血清和腦組織中的NO和PGE2水平均有顯著的降低作用。

綜上所述，飛機草的鎮(zhèn)痛部位既可能在中樞，又可能在外周，且其鎮(zhèn)痛作用與降低中樞和外周NO、PGE2水平有關(guān)。

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