陳浩宇，王 楠，葉田田，王淑君

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

非包衣乙?；?乳球蛋白腸溶片的制備及處方優(yōu)化

陳浩宇，王 楠，葉田田，王淑君*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的研究乙?；?乳球蛋白作為新型腸溶輔料的特性，制備乙?；?乳球蛋白為腸溶輔料的阿司匹林非包衣腸溶片，并對其進(jìn)行處方優(yōu)化。方法使用乙酸酐對β-乳球蛋白進(jìn)行乙酰化改性，考察改性后的β-乳球蛋白在不同pH環(huán)境下的溶解度及穩(wěn)定性。以阿司匹林為模型藥物，乙酰化β-乳球蛋白為腸溶填充輔料制備非包衣腸溶片，并利用Box-Behnken法對非包衣腸溶片的處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果乙酰化改性使β-乳球蛋白等電點(diǎn)向低pH端偏移，實(shí)現(xiàn)了乙?；?乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境下溶解度的降低和穩(wěn)定性的提高，因此顯現(xiàn)出了一定的腸溶釋藥性能。對制備的阿司匹林非包衣腸溶片進(jìn)行處方及工藝優(yōu)化后，實(shí)現(xiàn)了藥物在酸性條件下2 h釋放量低于2%且在中性環(huán)境下45 min釋放量達(dá)到97%的腸溶釋放效果。結(jié)論經(jīng)乙?；男缘摩?乳球蛋白可作為一種新型的腸溶輔料應(yīng)用于非包衣腸溶片的制備，所制備的非包衣腸溶片具有良好的腸溶釋藥效果。

藥劑學(xué)；非包衣腸溶片；響應(yīng)曲面法；乙酰化β-乳球蛋白；體外釋放

生物可降解材料由于其自身具有生物相容性高、安全無毒等特點(diǎn)，在藥物制劑領(lǐng)域中表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，尤其是多糖類和蛋白類物質(zhì)作為天然的可降解高分子材料在藥物傳遞系統(tǒng)中有著廣泛的研究。但是天然蛋白類物質(zhì)由于自身結(jié)構(gòu)的原因通常功能性較差，必須對其進(jìn)行適度的改性以滿足功能要求。傳統(tǒng)的蛋白改性方法主要分為四類[1]：酶法、化學(xué)法、物理法和基因工程法。其中化學(xué)法是蛋白類物質(zhì)改性途徑中最為常用的方法；乙?；ㄗ鳛槟壳白畛Ｒ姷牡鞍谆瘜W(xué)改性手段之一，有大量的研究和文獻(xiàn)表明經(jīng)乙酰化改性后的蛋白類物質(zhì)，其起泡性，乳化性、穩(wěn)定性均得到了一定程度的提高[2-3]。

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-lg)是牛乳乳清中的主要蛋白質(zhì)，其質(zhì)量約占總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量的50%及總?cè)榈鞍踪|(zhì)量的 12%。β-乳球蛋白作為乳清蛋白的主要成分，具有多樣的功能性，經(jīng)琥珀酰化改性后作為輔料用于非包衣腸溶片的制備已有文獻(xiàn)報道[4-5]。本文作者選用了乙酸酐對β-乳球蛋白進(jìn)行化學(xué)改性研究，考察乙?；男詫Ζ?乳球蛋白在不同pH環(huán)境下的溶解度和穩(wěn)定性影響，并針對由乙酰化β-乳球蛋白為輔料制備的非包衣腸溶片進(jìn)行了處方和工藝優(yōu)化。

1 儀器與材料

UV-2000紫外-可見分光光度計（尤尼柯(上海)儀器有限公司），壓片機(jī)（上海靈峰機(jī)械制造有限公司）；ZRCD6-B 型藥物溶出度測定儀（上海黃海藥檢儀器廠）。

β-乳球蛋白(β-lg，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90.0%，上海華壹生物科技有限公司），透析袋（截流相對分子質(zhì)量為1 000，上海斯百全化學(xué)有限公司），阿司匹林（aspirin，醫(yī)藥級，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，武漢宏信康精細(xì)化工有限公司），2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid hydrate disodium salt，BCA，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，成都貝斯特試劑有限公司)，乙酸酐、磷酸二氫鈉等其他試劑（分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 乙酰化β-乳球蛋白的制備

取50 g β-乳球蛋白在40 ℃磁力攪拌條件下溶解于500 mL蒸餾水中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的β-乳球蛋白溶液，取15 g乙酸酐在磁力攪拌條件下逐漸加入到蛋白溶液中，控制反應(yīng)溫度在40 ℃；反應(yīng)過程中以2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使其保持在8.0～ 8.5；反應(yīng)結(jié)束后，去離子水透析(4 ℃，24 h)，冷凍干燥即得[6]。

2.2 乙?；男詫Ζ?乳球蛋白溶解性的影響

通過改良的氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index，NSI) 方法估算乙?；男詫Ζ?乳球蛋白在不同pH環(huán)境下溶解性的影響。在不同pH值的100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液中加入過量的乙酰化β-乳球蛋白，室溫條件下靜置2 h后1 500 r·min-1離心10 min，取200 μL上清液與4 mL BCA試劑混合搖勻，37 ℃保溫30 min后冷卻至室溫，于562 nm處測定吸光度值。β-乳球蛋白溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線。NSI計算公式為：NSI=[w(ProtS)/w(ProtT)]×100%。其中：w(ProtS) 為上清液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，w(ProtT)為未經(jīng)離心的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其數(shù)值為0.2%[7]。

從圖1可以看到，經(jīng)乙?；男院蟮摩?乳球蛋白的溶解特性較未改性之前存在著明顯的差異。當(dāng)?shù)鞍姿幦芤旱膒H=pI時，蛋白具有最低的溶解度，β-乳球蛋白的等電點(diǎn)為5.2，經(jīng)乙?；男院蟮鞍椎入婞c(diǎn)向低pH端偏移至3.7，β-乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境下的溶解度顯著降低。在pH>5.2環(huán)境中，經(jīng)乙?；男缘摩?乳球蛋白的溶解度則在一定程度上得到了提高。

Fig. 1 The effect of acetylation on the solubility of β-lactoglobulin圖1 改性反應(yīng)對蛋白溶解度的影響

2. 3 模擬胃腸液中乙?；?乳球蛋白片的穩(wěn)定性

將乙?；?乳球蛋白通過粉末直接壓片的方式制備片重為500 mg的空白蛋白片，同法制備β-乳球蛋白片作為對照樣品。將兩種蛋白片分別置于在1 000 mL模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid，SIF)中，設(shè)置介質(zhì)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，在設(shè)定時間點(diǎn)取樣，同時補(bǔ)充相同體積的介質(zhì)。觀察片劑形態(tài)變化并使用紫外分光光度計在280 nm處檢測溶出介質(zhì)中的蛋白量，以此判斷蛋白片在不同介質(zhì)條件下的穩(wěn)定性。

經(jīng)觀察，乙?；?乳球蛋白片的片劑形態(tài)在模擬胃液環(huán)境中發(fā)生了顯著的變化，隨著測定時間的推移逐漸由片狀膨脹成為球狀，但在外觀上始終保持了較高的完整性；在模擬腸液中，?；鞍灼瑒t以較快的速度發(fā)生溶解，至70 min時片劑形態(tài)基本消失。

圖2a表明，乙?；?乳球蛋白片和β-乳球蛋白片在模擬胃液中具有明顯不同的穩(wěn)定性，β-乳球蛋白片在模擬胃液中2 h已基本溶解；乙?；鞍灼谀M胃液中則始終保持了較高的穩(wěn)定性，5 h后僅有占片劑總量質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%的乙酰β-乳球蛋白被模擬胃液溶解。圖2b表明，乙?；?乳球蛋白片和β-乳球蛋白片在模擬腸液中具有較為相似的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果表明，乙?；?乳球蛋白片和β-乳球蛋白片分別在75 min和90 min時就已完全溶解。

Fig. 2 The effect of acetylation on the stability of β-lactoglobulin in SGF(a) and SIF(b)圖2 乙?；男詫Φ鞍自谀M胃液(a)和模擬腸液(b)中的穩(wěn)定性影響

2.4 阿司匹林非包衣腸溶片的制備和體外釋藥性能研究

以乙酰化β-乳球蛋白為輔料，采用粉末直接壓片的方法制備載藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的阿司匹林非包衣腸溶片。將阿司匹林和乙?；?乳球蛋白分別過250 μm篩后，取50 mg阿司匹林與450 mg乙?；?乳球蛋白混合均勻，13 mm沖直接壓片，壓力為0.6 MPa，得到片劑質(zhì)量為500 mg的載藥乙?；?乳球蛋白片；同法制備載藥β-乳球蛋白片作為對照。按《中華人民共和國藥典》2010版二部附錄XD，采用溶出度測定法第一法裝置考察載藥蛋白片的體外釋藥情況[8]。以0.1 mol·L-1鹽酸溶液750 mL為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，依法操作，2 h后加入37 ℃的0.2 mol·L-1磷酸鈉溶液250 mL，混勻，用2 mol·L-1鹽酸溶液或2 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.8，繼續(xù)溶出至完全。在預(yù)設(shè)時間點(diǎn)取樣10 mL，同時補(bǔ)充相同體積的介質(zhì)，樣品溶液濾過后在265 nm處測定吸光度，按照如下公式計算藥物累積釋放度：Q=[(V×∑t-1n=1c+ ct×V0)/m]×100% 。其中：Q為藥物累積釋放度，V為取樣體積，V0為介質(zhì)體積，ct為各時間點(diǎn)實(shí)測濃度，m為制劑中主藥含量（mg）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由乙?；?乳球蛋白為輔料制備的載藥蛋白片初步具備腸溶釋放性能。圖3表明，載藥β-乳球蛋白片在酸中1 h藥物釋放量已接近100%，而載藥乙?；?乳球蛋白片在酸性介質(zhì)中2 h藥物釋放量僅為6%，符合《中華人民共和國藥典》對阿司匹林腸溶片在酸性介質(zhì)中2 h釋放量不高于10%的要求；在溶出介質(zhì)被更換為pH值6.8的磷酸鹽緩沖液后，該片劑的釋放速度明顯加快，45 min后藥物累積釋放量為64%，略低于《中華人民共和國藥典》對阿司匹林腸溶片在pH值6.8磷酸鹽緩沖液中45 min釋放量不低于70%的要求。因此，考慮在進(jìn)一步的處方優(yōu)化過程中加入少量的崩解劑，使乙?；?乳球蛋白片具備更好的腸溶釋藥性能。

Fig. 3 Release profiles of protein tablets in 0.1 mol·L-1HCL-pH 6.8 PBS medium圖3 載藥蛋白片在0.1 mol·L-1鹽酸溶液-pH6.8磷酸鹽緩沖液中釋放曲線

2.5 非包衣腸溶片的處方和工藝優(yōu)化

2.5.1 處方及工藝設(shè)計

為進(jìn)一步優(yōu)化乙?；?乳球蛋白為輔料制備的非包衣腸溶片的腸溶釋藥效果，選取微晶纖維素（MCC）為崩解劑，采用主藥（阿司匹林）與崩解劑經(jīng)干法制粒后，外加乙?；鞍纵o料混合均勻壓片的方式制備非包衣腸溶片，保證藥物在酸中低釋放量的同時提高其在中性環(huán)境下的釋放速度。

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定影響藥物釋放的主要因素為乙?；鞍子昧?(X1)和崩解劑用量(X2)及制片壓力(X3)，其極值范圍分別為：X1(450～550 mg)、X2(25～75 mg)和X3(0.5～1.5 MPa)，采用判定公式：Y=100% -︱P1-0%︱-︱P2-100%︱（P1為藥物在0.1 mol·L-1鹽酸溶液中的累積釋放度、P2為藥物在pH值6.8磷酸鹽緩沖液中的累積釋放度）判斷實(shí)際釋放度與預(yù)期釋放度（藥物在0.1 mol·L-1鹽酸溶液中無釋放，在pH值6.8磷酸鹽緩沖液中100%釋放）的符合程度，計算響應(yīng)值Y。

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計的原理，每個因素設(shè)置上下限水平為X1(450～550 mg)、X2(25～75 mg)和X3(0.5 ～1.5 MPa)，各因素及其水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

Table 1 Independent variables and levels investigated in the BBD表1 響應(yīng)面中心組合設(shè)計因素與水平表

Table 2 Factor levels and observed responses for BBD表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計以及效應(yīng)值

2.5.2 模型擬合

將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析，以實(shí)際釋放量與預(yù)期釋放量的符合程度作為效應(yīng)值進(jìn)行方程擬合，經(jīng)軟件對表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后，發(fā)現(xiàn)用二次階多項(xiàng)式回歸較優(yōu)，得到以X1、X2、X3為自變量的二次回歸方程模型如下：

Y= -374.0 + 1.97X1-1.68X2+ 2.60X3+ 5.60 × 10-3X1X2-4.0×10-3X1X3+ 2.4×10-2X2X3-2.2×10-3X12-1.36×10-2X22-8.0×10-2X32(R2=0.963 2，P=0.000 3＜0.01)

上述方程的擬合度良好，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明多元線性模型可較好地描述各因素與指標(biāo)之間的定量關(guān)系，可以用此模型進(jìn)行處方分析和預(yù)測。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件繪制各效應(yīng)對因素的效應(yīng)面圖和等高線圖，見圖4-6。

Fig. 4 Response surfaces (a) and 2D contour plot (b) with Argument X1 & X2圖4 X1與X2自變量的效應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)

Fig. 5 Response surfaces (a) and 2D contour plot (b) with Argument X1& X3圖5 X1與X3自變量的效應(yīng)面圖(a)和等高線圖

Fig. 6 Response surfaces (a) and 2D contour plot (b) with Argument X2& X3圖6 X2與X3自變量的效應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)

通過各主要因素的用量范圍和Design-Expert 8.0.5軟件對緩釋片處方進(jìn)行預(yù)測，分析結(jié)果，確定最佳處方為每片(550 mg)含主藥40 mg、乙?；鞍纵o料470 mg、崩解劑微晶纖維素40 mg，制片壓力為0.9 MPa。

2.5.3 處方優(yōu)化驗(yàn)證

在預(yù)測最優(yōu)處方的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3批樣品放大實(shí)驗(yàn)，考察0.1 mol·L-1鹽酸溶液-pH值6.8磷酸鹽緩沖液中的釋放行為，結(jié)果見表3。

Table 3 The verification of the optimized formulation表3 優(yōu)化處方的驗(yàn)證

由表3可知，在優(yōu)化范圍內(nèi)，處方的理論值與實(shí)測值能夠很好的吻合，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。這表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選工藝條件具有較好的重現(xiàn)性。

3 討論與結(jié)論

a. 乙酰化改性手段可有效地降低β-乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境下的溶解度，提高其在模擬胃液環(huán)境中的穩(wěn)定性；在pH>5.2環(huán)境中，經(jīng)乙?；男缘摩?乳球蛋白的溶解性能較未改性之前有著明顯的提高。這是由于乙酰化反應(yīng)向β-乳球蛋白引入了中性的乙?；鶊F(tuán)，導(dǎo)致蛋白中可解離的陽離子基團(tuán)減少，β-乳球蛋白的等電點(diǎn)向低 pH端偏移，使其在酸性環(huán)境中的電荷密度和溶解度有了明顯的降低；在高于蛋白等電點(diǎn)區(qū)域，由于乙酰基對蛋白質(zhì)分子中的氨基陽離子的封閉使得蛋白質(zhì)分子間的靜電作用減弱，降低了蛋白質(zhì)分子間的聚集作用，使其水溶性增大[6]。采用粉末直接壓片方式制備的非包衣腸溶片，雖然在酸性介質(zhì)中2 h釋放量符合藥典對阿司匹林腸溶片釋放度的相關(guān)規(guī)定，但是其在中性條件下的釋放量卻偏低，因此考慮向制劑中加入一定量的崩解劑以提高藥物在中性環(huán)境下的釋放速度。選取主藥與崩解劑干法制粒后外加?；鞍纵o料混合壓片的方式制備非包衣腸溶片，既減少了藥物在低 pH環(huán)境下與酸性介質(zhì)的接觸面積，保證了較低的藥物釋放量；同時在中性環(huán)境中，伴隨著乙?；?乳球蛋白的溶解，崩解劑的加入有效地加快了藥物的釋放速度。

b. 改性β-乳球蛋白的這一特性能夠有效地應(yīng)用于口服緩控釋給藥系統(tǒng)當(dāng)中，尤其是作為一種新型的輔料應(yīng)用于非包衣腸溶片的制備，極大地降低了制備腸溶片的工藝難度和時間成本。此外針對其改性后在胃液環(huán)境中較好的抗酸能力和穩(wěn)定性，其作為載體屏障在生物大分子類藥物口服給藥和結(jié)腸靶向給藥方面同樣具有廣闊的研究和應(yīng)用前景。

c. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)乙?；男院?，β-乳球蛋白的等電點(diǎn)由5.2向低pH端偏移至3.7。乙?；男钥捎行У亟档挺?乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境中的溶解度、提高在胃液環(huán)境下穩(wěn)定性，同時提高其在pH>5.2環(huán)境下的溶解度。此外通過乙?；?乳球蛋白與崩解劑的聯(lián)合應(yīng)用及Box-Behnken響應(yīng)曲面法對所制備的非包衣腸溶片的處方和工藝的優(yōu)化，在有效降低藥物在酸性條件下釋放量的同時顯著的提高了藥物在中性環(huán)境下的釋放速度，提高了制劑的腸溶釋藥性能。

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The preparation of uncoated enteric tablets with acetylated β-lactoglobulin as excipients and optimization of the prescription

CHEN Hao-yu, WANG Nan, YE Tian-tian, WANG Shu-jun*
（School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveThe acetylated β-lactoglobulin was studied for the application in the preparation of uncoated enteric tablet as a new excipient.MethodsThe solubility and stability of acetylated β-lactoglobulin at different pH were investigated. The aspirin uncoated enteric tablet was prepared with modified β-lactoglobulin and the formula was optimized by Box-Behnken method.Resultsthe isoelectric point and the solubility of β-lactoglobulin decreased with the modification, but the stability of protein was increased at pH<5.2. The uncoated enteric tablets with aspirin maintained the accumulated amount of drug released under 2% within 2 hours at acid pH while 97% drug released in 45 mins at intestinal pH after the optimization of the formulation.ConclusionThe β-lactoglobulin, with modification of acetylation and appropriate formula, was potentially applied in the preparation of uncoated enteric tablets.

pharmaceutics; uncoated enteric tablet; Box-Behnken; acetylated β-lactoglobulin; in vitro dissolution

R 94

：A

(本篇責(zé)任編輯：呂向一)

2014-10-09

陳浩宇（1987-），男(漢族)，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，E-mail 383015618@qq.com；＊通訊作者： 王淑君（1972-），女（漢族），遼寧沈陽人，博士，教授，主要從事藥物新劑型研究，Tel. 024-23986360，E-mail xiaohu6408-cn@sina.com。

(2015)03-0107-10

10.14146/j.cnki.cjp.2015.03.004