樸成玉 ,房 城 ,張 穎 ,陳婷婷 ,周忠光

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

白花敗醬草（Patrina villosa Juss,PVJ）系敗醬科植物，藥用其全草，味辛，性寒［1］。白花敗醬出自《本草綱目》［2］，敗醬草來源為黃花敗醬（Patrinia scabiosaef olia Fisch）和白花敗醬（Patrinia villosa Juss），以全草入藥，應(yīng)稱為白花敗醬草［3］，具有清熱解毒、利濕排膿、活血化瘀、鎮(zhèn)心安神的功效，近年來白花敗醬草的抗腫瘤作用備受關(guān)注［4］。實(shí)驗(yàn)通過MTT法和細(xì)胞形態(tài)觀察，考察白花敗醬草有效部位對Siha細(xì)胞的體外抑制作用。

1 材料

1.1 藥材與試劑

白花敗醬草有效部位（本實(shí)驗(yàn)室自制,含有總皂苷61.81%，總黃酮8.69%）；順鉑注射液，江蘇豪森。

1.2 細(xì)胞株與試劑

人子宮頸鱗癌細(xì)胞Siha、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（均購自上海佛雷堡）；噻唑藍(lán)（購自Sigma）；二甲基亞砜（購自Amresco）。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀（上海熱電）；CO2培養(yǎng)箱（NAPCO）；Olympus倒置顯微鏡；生物潔凈工作臺（蘇州安泰）。

2 方法

2.1 藥液的配制

本實(shí)驗(yàn)分為不同濃度的白花敗醬草有效部位組、順鉑組、空白組，共八組。分別精密移取儲備液（6.4mg/mL） 用培養(yǎng)液稀釋為 20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL 六種不同濃度的白花敗醬草有效部位溶液；順鉑注射液用培養(yǎng)液稀釋制得濃度為5μg/mL的陽性藥藥液。

2.2 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)

采用MTT法檢測。選取對數(shù)生長期的Siha細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/mL，分別接種于96孔板培養(yǎng)，每孔100μL。培養(yǎng)24h加不同濃度的白花敗醬草有效部位藥液、順鉑藥液、RAPM1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入5μg/mL的MTT20μL。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150mL，輕輕震蕩10min，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度（A），檢測波長為570nm。抑制率（%）=（1-A藥液組/A空白對照組）×100%。

2.3 對細(xì)胞形態(tài)的影響

選取對數(shù)生長期的Siha細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL，分別接種于6孔板培養(yǎng)，每孔100μL。培養(yǎng)24h后分別加白花敗醬草有效部位藥液（320μg/mL）、順鉑藥液（5μg/mL）、RAPM1640 培養(yǎng)液 200μL 繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 0h、6h、12h、24h 用光學(xué)顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)

不同濃度的白花敗醬草有效部位對Siha細(xì)胞的生長均有不同程度的抑制作用，40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL 劑量組與空白組相比均有顯著性差異（P＜0.05），并呈劑量依賴關(guān)系；各濃度組對細(xì)胞的抑制率隨時間延長而增高，呈時間依賴關(guān)系，詳見表1。

表1 白花敗醬草有效部位對Siha細(xì)胞生長的抑制作用（X±SD-）Tab.1 Inhibitory effect ofPatrinia villosaactive composition on Siha cell

3.2 對細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察空白組細(xì)胞呈上皮型貼壁生長，細(xì)胞呈延展、扁平，細(xì)胞均質(zhì)而透明，細(xì)胞一般有2～4個核仁，核膜、核仁輪廓明顯，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞生長旺盛，給藥組細(xì)胞輪廓增強(qiáng)、反差增大，變圓浮起，細(xì)胞間接觸變松，增殖減慢，胞質(zhì)中顆粒增多，見圖1。

圖1 白花敗醬草有效部位及順鉑陽性藥對Siha細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響Fig.1 Study on influence of Patrinia villosa activecomposition and cisplatin to Siha cells apoptosis morphology

4 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐漸上升，嚴(yán)重危害婦女健康，其治療費(fèi)用昂貴且治愈率低，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白花敗醬草有效部位對Siha細(xì)胞有顯著的生長抑制作用，其抑制率與藥物的作用濃度和作用時間呈依賴關(guān)系。其中作用時間為48h時，藥物濃度在20～640μg/mL范圍內(nèi)量效關(guān)系變化比較均一，作用時間為72h，藥物濃度超過320μg/mL時，抑制率的變化較緩慢。白花敗醬草有效部位對Siha細(xì)胞的抑制作用明確，但其作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

［1］ 宋立人.現(xiàn)代中藥大辭典［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001：1268.

［2］ 盧寅熹.敗醬草的本草考證［J］.時珍國藥研究，1996，7（3）：129.

［3］ 王立軍，李運(yùn)景.敗醬草的本草考證［J］.中草藥，2004，35（6）：696-697.

［4］ 宋婷，孫暉，路娟，等.白花敗醬草體外抗腫瘤活性部位篩選［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（10）：2410-2412.