秦海瑜，陳宇輝

(臨高縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 臨高 571800)

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微RNA在乙型肝炎病毒感染不同時(shí)期表達(dá)譜的變化及其意義

秦海瑜※，陳宇輝

(臨高縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 臨高 571800)

摘要：目的探究微RNA(miRNA)在乙型肝炎病毒感染不同時(shí)期表達(dá)譜的變化及其意義。方法選取2012年3月至2014年1月于臨高縣人民醫(yī)院就診的乙型肝炎病毒(HBV)感染者200例，其中急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者和健康對(duì)照組各50例，提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞后，分離信使RNA，采用RNA-DNA嵌合探針液態(tài)芯片技術(shù)檢測(cè)miR-20a、miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371、miR-223、miR-126的表達(dá)水平。結(jié)果不同時(shí)期HBV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-20a的表達(dá)水平隨HBV感染的發(fā)展而升高， miR-126隨HBV感染的發(fā)展而降低，miR-223在急性乙型肝炎中的表達(dá)水平最高(15.44±8.52)，在肝癌組中的表達(dá)水平最低(6.87±2.11)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HBV感染發(fā)展不同時(shí)期的miRNA表達(dá)譜是不同的，通過檢測(cè)相關(guān)miRNA的表達(dá)，可以為HBV感染的慢性化發(fā)展提供一個(gè)新的研究視角。

關(guān)鍵詞：肝癌；微RNA；乙型肝炎

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，我國1～59歲人群中HBV攜帶率約為7.18%[1]。感染HBV后肝臟反復(fù)損傷和修復(fù)可以引發(fā)慢性乙型肝炎，隨著病程遷移，有可能進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，微RNA(microRNA，miRNA)在HBV感染的相關(guān)疾病中可能起到重要作用[3]，但是目前HBV感染者、慢性乙型肝炎、肝硬化患者和肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miRNA的表達(dá)水平變化鮮有報(bào)道。為準(zhǔn)確地檢測(cè)患者病情的動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，本研究通過檢測(cè)HBV感染相關(guān)肝病不同階段患者PBMC中相關(guān)miRNA的變化，探究miRNA在HBV感染相關(guān)肝病中的作用及其在臨床治療中的意義。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年3月至2014年1月于臨高縣人民醫(yī)院就診的HBV感染者200例。納入標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)于2010年聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)前接受過放化療的患者，患有其他(如自身免疫性肝炎、脂肪肝、酒精肝、藥物性肝病等)肝臟疾病的患者，妊娠期婦女，嚴(yán)重心、腎疾病患者。依據(jù)患者診斷情況分為：急性乙型肝炎50例，男30例、女20例，年齡34～61歲，平均(46±12)歲；慢性乙型肝炎50例，男25例、女25例，年齡33～60歲，平均(43±10)歲；肝硬化50例，男28例、女22例，年齡32～59歲，平均(45±10)歲；肝癌50例，男30例、女 20例，年齡32～60歲，平均(49±11)歲。對(duì)照組50例，為在臨高縣人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人，男25例、女25例，年齡34～59歲，平均(44±12)歲。各組患者及健康對(duì)照的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1試劑Ficoll淋巴細(xì)胞提取液(上海研卉生物科技有限公司)，總RNA提取試劑盒(Labaide)，RNA酶抑制劑(上海合星生物科技有限公司)，Trizol(大連寶生物有限公司)，微球(Bio-Rad)，探針序列和微球捕捉序列(上海生工生物工程有限公司)，RNA-DNA嵌合探針(上海吉瑪生物公司)。

1.2.2儀器離心機(jī)(Termo)，PCR儀(Bio-Rad)，紫外分光光度計(jì)(上海儀電分析儀有限公司)，Luminex液態(tài)芯片分析系統(tǒng)(Luminex)。

1.2.3檢測(cè)方法①標(biāo)本采集：常規(guī)采集患者外周血5 mL，稀釋后加入Ficoll淋巴細(xì)胞提取液，以重力加速度500 g離心10 min，后用毛細(xì)管吸出灰色的PBMC。②總RNA的提?。涸诜蛛x出的PBMC中加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打。嚴(yán)格按照總信使RNA提取試劑盒說明提取總RNA，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值(A)，當(dāng)A260/A280的比值在1.9～2.1，且其最低濃度高于250 mg/L時(shí)加入RNA酶抑制劑，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。③RNA-DNA嵌合探針液態(tài)芯片檢測(cè)miRNA：實(shí)驗(yàn)中用到的探針序列和微球捕捉序列均用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成，具體詳見表1；實(shí)驗(yàn)中使用miR-103作為內(nèi)參，將待檢樣本和內(nèi)參在PCR儀中與嵌合探針進(jìn)行雜交后，加入包被好的微球，反應(yīng)30 min后在反應(yīng)體系中加入2.5 μL 酶切反應(yīng)液，30 ℃下反應(yīng)30 min；最后加入熒光染料，在Luminex液態(tài)芯片儀上檢測(cè)熒光；檢測(cè)時(shí)取內(nèi)參讀數(shù)的3次熒光信號(hào)平均讀數(shù)作為有效內(nèi)參數(shù)值，取(靶miRNA分子平均熒光強(qiáng)度-對(duì)應(yīng)本底平均熒光強(qiáng)度)/(有效內(nèi)參熒光強(qiáng)度-對(duì)應(yīng)本底平均熒光強(qiáng)度)為有效數(shù)據(jù)。

表1　RNA-DNA嵌合探針序列和微球捕捉序列

2結(jié)果

miR-20a、miR-223、miR-126這三種miRNA在各組間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-20a在肝癌組中的表達(dá)水平高于對(duì)照組、急性乙型肝炎組、慢性乙型肝炎組和肝硬化組(P<0.05)；其在肝硬化組中的表達(dá)水平高于對(duì)照組、慢性肝炎組和急性肝炎組(P<0.05)；其在慢性乙型肝炎組中的表達(dá)也稍高于對(duì)照組和急性乙型肝炎組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-223在肝癌組的表達(dá)水平低于對(duì)照組、急性乙型肝炎組和慢性乙型肝炎組(P<0.05)；其在肝癌組中的表達(dá)水平也稍低于肝硬化組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-223在肝硬化組的表達(dá)水平也低于急性乙型肝炎組(P<0.05)。miR-126在肝癌組中的表達(dá)水平低于對(duì)照組、急性乙型肝炎組和慢性乙型肝炎組(P<0.05)；miR-126 在肝硬化組中的表達(dá)水平低于對(duì)照組和急性乙型肝炎組(P<0.05)；其在肝癌組中的表達(dá)稍低于在肝硬化組中的表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組miR-21、miR-31、 miR-145、miR-222、miR-191、miR-372比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　HBV感染不同時(shí)期外周血中單個(gè)核細(xì)胞的miRNA的表達(dá)結(jié)果　±s)

HBV：乙型肝炎病毒；對(duì)照組：健康者；a與對(duì)照組比較，P<0.05;b與急性乙型肝炎組比較,P<0.05；c與慢性乙型肝炎組比較,P<0.05

3討論

miRNA是一種以序列特異性調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA，普遍參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡、炎癥等一系列生理及病理過程[5]。miRNA可與目的基因的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，通過堿基配對(duì)導(dǎo)致目的信使RNA降解，或者通過非完全堿基配對(duì)阻礙信使RNA的翻譯[6]。目前為止miRBase數(shù)據(jù)庫中已有1424種人類的miRNA、720種小鼠的miRNA和408種大鼠的miRNA[7]。利用miRNA來診斷甚至治療疾病已成為熱點(diǎn)[8- 9]。miRNA不僅存在于各種細(xì)胞中，而且可被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，并可以在大多數(shù)體液中檢測(cè)到。

本研究結(jié)果表明，miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371在HBV感染者和對(duì)照組PBMC中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這5種miRNA與HBV感染及各個(gè)時(shí)期的發(fā)展沒有關(guān)系。miR-20a的表達(dá)水平隨著HBV感染的發(fā)展而逐步提高，提示miR-20a可能參與了HBV感染者病情的發(fā)展過程，還可能是肝癌的重要致病性miRNA分子之一。miR-223在急性乙型肝炎中表達(dá)量最高，在肝癌組表達(dá)量最低；miR-126的表達(dá)水平隨著HBV感染的發(fā)展而逐步降低，提示miR-223和miR-126這兩種miRNA的表達(dá)水平可能與HBV的慢性化發(fā)展緊密相關(guān)。miR-20a在多種疾病中均報(bào)道有異常表達(dá)情況，可能起著癌基因的作用[10]。如在膽囊癌患者組織中miR-20a表達(dá)水平顯著高于正常人，且隨著病情的加重miR-20a的表達(dá)量升高[11]；miR-20a在胃癌組織中也存在高表達(dá)情況，其可能也與胃癌的原位發(fā)生密切相關(guān)[12]。miR-223的表達(dá)水平在肝癌患者中最低，在急性乙型肝炎患者中最高；miR-126的表達(dá)水平隨著HBV感染的發(fā)展而逐步降低，說明這兩個(gè)miRNA的表達(dá)水平可能與HBV感染的不同時(shí)期有關(guān)。miR-223為粒細(xì)胞系中高表達(dá)的一種控制炎性反應(yīng)的分子[13]。曾有報(bào)道，miR-223基因缺失的小鼠粒細(xì)胞表型高度成熟，對(duì)刺激的敏感度、殺菌功能均有所增強(qiáng)，導(dǎo)致小鼠易患肺炎，組織損傷加劇[14-15]。本研究在HBV感染發(fā)展程度最高的肝癌患者PBMC中的表達(dá)量明顯偏低，可能會(huì)引起粒細(xì)胞功能過強(qiáng)，從而引起高炎癥反應(yīng)。這可能也是HBV感染后病情發(fā)展的一個(gè)因素。miR-126位于EGFL7 基因的內(nèi)含子中，在正常人含血管豐富的組織中高表達(dá)。miR-126是一種抑癌基因，目前普遍認(rèn)為其可以抑制一些腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，其在胃癌、乳腺癌、原發(fā)性膀胱腫瘤等疾病中表達(dá)量明顯降低[16]。

綜上所述，從HBV急性感染經(jīng)過慢性乙型肝炎、肝硬化發(fā)展到肝癌的過程中不同miRNA的表達(dá)譜可能會(huì)隨著病情的發(fā)展而變化。本研究結(jié)果顯示，miR-20a、 miR-223、miR-126三種miRNA的表達(dá)水平均隨著HBV感染后病情的發(fā)展而變化，通過監(jiān)測(cè)相關(guān)miRNA的變化可以為相關(guān)疾病的發(fā)展機(jī)制提供新的研究視角。

參考文獻(xiàn)

[1]王濤,陳東風(fēng).乙型肝炎病毒受體研究近況與展望[J].肝臟,2013，18(7):493-495.

[2]李靜,李朝霞,毛維武,等.乙型肝炎病毒感染與肝細(xì)胞癌關(guān)系的新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(18):2988-2991.

[3]Li LM,Hu ZB,Zhou ZX,etal.Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma[J].Cancer Res,2010,70(23):9798-9807.

[4]Cuperus JT,Fahlgren N,Carrington JC.Evolution and functional diversification of MIRNA genes[J].Plant Cell,2011,23(2):431-442.

[5]Marín RM,Vanícekek J.Efficient use of accessibility in microRNA target prediction[J].Nucleic Acids Res,2011,39(1):19-29.

[6]Kozomara A,Griffiths-Jones S.miRBase:integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J].Nucleic Acids Res,2011,39(suppl 1):152-157.

[7]Borel F,Konstantinova P,Jansen PL.Diagnostic and therapeutic potential of miRNA signatures in patients with hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2012,56(6):1371-1383.

[8]Pin AL,Houle F,Guillonneau M,etal.miR-20a represses endothelial cell migration by targeting MKK3 and inhibiting p38 MAP kinase activation in response to VEGF[J].Angiogenesis,2012,15(4):593-608.

[9]Chang Y,Liu C,Yang J,etal.miR-20a triggers metastasis of gallbladder carcinoma[J].J Hepatol,2013,59(3):518-527.

[10]Wang M,Gu H,Wang S,etal.Circulating miR-17-5p and miR-20a:molecular markers for gastric cancer[J].Mol Med Report,2012,5(6):1514-1520.

[11]Bauernfeind F,Rieger A,Schildberg FA,etal.NLRP3 inflammasome activity is negatively controlled by miR-223[J].J Immunol,2012,189(8):4175-4181.

[12]Nakanishi K,Nakasa T,Tanaka N,etal.Responses of microRNAs 124a and 223 following spinal cord injury in mice[J].Spinal Cord,2009,48(3):192-196.

[13]Johnnidis JB,Harris MH,Wheeler RT,etal.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223[J].Nature,2008,451(7182):1125-1129．

[14]劉艷紅,趙艷潔,房淑娟,等.肝癌相關(guān)基因的分子克隆和可變剪切分析[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2013,38(9):869-875.

[15]Feng R,Chen X,Yu Y,etal.miR-126 functions as a tumour suppressor in human gastric cancer[J].Cancer Lett,2010,298(1):50-63.

[16]Hamada S,Satoh K,Fujibuchi W,etal.MiR-126 acts as a tumor suppressor in pancreatic cancer cells via the regulation of ADAM9[J].Mol Cancer Res,2012,10(1):3-10.

統(tǒng)一同一時(shí)體論：宇宙無限。包括萬事、萬物；有機(jī)、無機(jī)；生命、非生命；物質(zhì)、精神等，所有都包容在宇宙體內(nèi)，是一個(gè)統(tǒng)一體，是一個(gè)完整的體系。宇宙間的任何個(gè)體，都發(fā)生在某時(shí)間段與變化的空間內(nèi)，所以任何個(gè)體均是時(shí)間和空間共同構(gòu)建成的同一時(shí)體。宇宙間的任何個(gè)體被各種各樣的規(guī)律控制著，若大的宇宙與大小不一的個(gè)體，都在循道規(guī)律而動(dòng)。無限與有限，宏觀與微觀，整體與部分都遵循著統(tǒng)一同一時(shí)體和諧的運(yùn)動(dòng)。和諧地運(yùn)動(dòng)維護(hù)了統(tǒng)一，運(yùn)動(dòng)地和諧維護(hù)了同一。

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Expression Profile and Significance of miRNA in Different Periods of HBV InfectionQINHai-yu，CHENYu-hui.(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofLingaoCounty，Lingao571800，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the expression profile and significance of miRNA different periods of HBV infection.MethodsTwo hundred patients infected by HBV from Lingao County People′s Hospital during Mar.2012 and Jan.2014 were selected in this study.Among them,there were 50 patients with acute hepatitis B,50 with chronic hepatitis B,50 with hepatitis B liver cirrhosis,50 with liver cancer and 50 healthy control.The expression level of miR-20a,miR-21,miR-31,miR-145,miR-222,miR-191,miR-371,miR-223 and miR-126 were detected by xMap liquid chip technology after extracting mononuclear cells from peripheral blood.ResultsThere were no statistically differences of miR-21miR-31,miR-145,miR-222,miR-191,miR-371 in different groups(P>0.05).As the progression of the disease,the expression level of miR-20a increased significantly,while miR-126 decreased greatly.The expression level of miR-223 was the highest in acute hepatitis B group (15.44±8.52),while it was the lowest in the liver cancer group (6.87±2.11),the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression profile of miRNA in different periods of HBV infection is different,which provides a new clue to the research of the mechanisms of the chronicity of HBV infection.

Key words:Liver cancer; MicroRNA; Hepatitis B

收稿日期：2014-05-26修回日期：2015-06-15編輯：樓立理

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.071

中圖分類號(hào)：R512.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)19-3647-03