朱　黎，成旭東，安燕芳

(徐州市第一人民醫(yī)院老年科，江蘇 徐州 221000)

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阿爾茨海默病患者外周血單核細(xì)胞中CD33的表達(dá)情況

朱黎※，成旭東，安燕芳

(徐州市第一人民醫(yī)院老年科，江蘇 徐州 221000)

摘要：目的研究阿爾茨海默病(AD)患者外周血單核細(xì)胞CD33的表達(dá)情況，探討其作為血液生物標(biāo)志物的可行性。方法收集2011年1月至2013年3月徐州市第一人民醫(yī)院收治的100例AD患者(AD組)和100例認(rèn)知正常老年人(對(duì)照組)的臨床資料和外周靜脈血標(biāo)本,分離外周血單核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)測(cè)定CD33mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀分析CD33陽性細(xì)胞率。采用Pearson相關(guān)分析CD33表達(dá)與簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評(píng)分的關(guān)系。結(jié)果AD患者CD33mRNA表達(dá)水平和CD33陽性細(xì)胞率均顯著低于對(duì)照組[0.89±0.28 比1.06±0.33；(40±15)%比(55±21)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CD33mRNA表達(dá)水平、CD33陽性細(xì)胞率與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.78，0.22，P<0.05)。結(jié)論CD33可能參與AD的發(fā)病過程，CD33作為AD臨床診斷生物標(biāo)志物具有一定的可行性。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；CD33；外周血單核細(xì)胞；生物標(biāo)志物

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種最常見的年齡相關(guān)性癡呆,60歲以上人群患病率高達(dá)1.6%，目前AD患者約530萬人，2050年預(yù)計(jì)將達(dá)到1350萬人，AD已成為一種嚴(yán)重影響老年人身心健康的公共衛(wèi)生問題[1]。由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，疾病產(chǎn)生的原因和機(jī)制尚不明切，目前仍無有效治療方法，且發(fā)病隱匿，只有當(dāng)個(gè)體表現(xiàn)出認(rèn)知、行為障礙時(shí)才能進(jìn)行診治，因此，對(duì)AD早期診斷并干預(yù)治療具有重要價(jià)值[2]。但批準(zhǔn)的、公認(rèn)的用于AD檢測(cè)的生物標(biāo)志物尚不存在，疾病的發(fā)生、進(jìn)展無法得以確定。CD33分子主要存在于血液、骨髓和淋巴細(xì)胞中，相對(duì)分子質(zhì)量為67 000，屬于唾液酸結(jié)合免疫球蛋白的凝集素家族成員，大范圍全基因組相關(guān)研究表明，CD33與AD密切相關(guān)[3-4]。本研究主要探討CD33的表達(dá)與AD患者認(rèn)知功能的關(guān)系，為AD診斷和治療提供思路和依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年1月至2013年3月徐州市第一人民醫(yī)院收治的符合精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)[5]及美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]的AD患者100例(AD組)，記憶障礙和遺忘為主訴，病程6個(gè)月至4年。采用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination，MMSE)和蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(montreal cognitive assessment，MoCA)對(duì)患者進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他癡呆相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如癲癇、帕金森病、亨廷頓病、抑郁癥、精祌分裂癥、精神發(fā)育遲滯者；②藥物濫用，有既往腦血管病、腦積水、腦炎或腦膜炎病史者；③頭部外傷或各類中毒導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙者；④嚴(yán)重的肝、腎功能損害及惡性腫瘤患者；⑥嚴(yán)重視覺或聽覺障礙，不能配合檢查者。另擇上述AD組患者配偶或同期收治的認(rèn)知正常的老年人為對(duì)照組,共100例，對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)同AD組。

1.2外周血單核細(xì)胞分離清晨空腹采集外周靜脈血約2 mL，乙二胺四乙酸抗凝血，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋后，緩慢加入5 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(BD，美國(guó))，以離心半徑13 cm，2000 r/min離心20 min，分離中間的血漿單核細(xì)胞層，PBS沖洗2次，以離心半徑13 cm，1500 r/min，離心10 min，棄上清液，收集下層液以PBS稀釋調(diào)整濃度，配制成1×106/mL的細(xì)胞懸液備用。

1.3CD33mRNA定量檢測(cè)分離出外周血單核細(xì)胞后，采用Trizol試劑盒(天澤恩，中國(guó))提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，中國(guó))將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光定量檢測(cè)試劑盒(Takara，中國(guó))，CD33引物為F端序列:5′-GAAAGCAGCCAGGACAGCA-3′，R端序列： 5′-CTGAACAGCTTGAGGGTT-TCAGTG-3′；甘油三磷酸脫氫酶引物為F端序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、R端序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀(BIORAD，美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系：包括2×SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)緩沖液10 μL,4種引物各0.4 μL(10 μmol/L)，cDNA模板2 μL，雙蒸水6.4 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本2個(gè)復(fù)孔，2-ΔΔCT法計(jì)算CD33mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1兩組受試者一般特征的比較兩組性別、年齡、受教育年限比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AD組MMSE和MoCA 評(píng)分均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1　兩組受試者一般特征的比較

AD：阿爾茨海默?。籑MSE：簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表；MoCA：蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表；a為χ2值，余為t值

圖1　CD33陽性流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)　1A：對(duì)照組； 1B：阿爾茨海默病組

圖2　對(duì)照和阿爾茨海默病(AD)組外周血單核細(xì)胞CD33表達(dá)　2A： CD33 mRNA相對(duì)表達(dá)量； 2B： CD33陽性率2.3　AD患者CD33表達(dá)與MMSE的相關(guān)性分析　CD33 mRNA表達(dá)與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.78，P<0.05)；CD33陽性單核細(xì)胞比率與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.22，P<0.05)。

3討論

CD33屬于免疫球蛋白超家族的成員,與蛋白酪氨酸磷酸酶結(jié)合向細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制性信號(hào)，參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子分泌等過程[7]。但目前CD33的信號(hào)傳遞通路仍沒有很好地描述,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@示[8-9]，其下游信號(hào)分子包括泛素連接酶、脾酪氨酸激酶等。在髓系細(xì)胞中脾酪氨酸激酶信號(hào)通路與細(xì)胞黏附、增殖、分化、凋亡有關(guān)。CD33屬于髓系分化抗原,主要分布于髓系細(xì)胞,其研究主要是急性髓系白血病治療,已有一些以CD33為靶點(diǎn)的藥物處于臨床研究階段，用于白血病的治療[10]。病理組織學(xué)顯示，AD患者大腦皮質(zhì)CD33異常表達(dá)[11]。一項(xiàng)關(guān)于中國(guó)北方漢族人群遲發(fā)型AD的全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，CD33基因與AD發(fā)病密切相關(guān)[12]。

由于AD主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，MMSE是最常用的癡呆及認(rèn)知功能評(píng)價(jià)表，量表包含記憶力、視空間功能、執(zhí)行功能、注意力、計(jì)算力、語言功能、定向力等方面的內(nèi)容，具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，以MMSE得分反映認(rèn)知功能受損程度具有一定的特異性[16]。本研究探討了CD33表達(dá)水平和認(rèn)知功能的相關(guān)性，Pearson相關(guān)分析表明，AD患者外周血單核細(xì)胞的CD33mRNA表達(dá)水平和CD33陽性單核細(xì)胞率與MMSE得分呈正相關(guān)，提示檢測(cè)外周血單核細(xì)胞CD33表達(dá)水平作為AD預(yù)測(cè)的標(biāo)志物具有一定的應(yīng)用潛力。CD33在急性髓系白血病相關(guān)的鑒別診斷中已顯示了較好的敏感性[17]。有研究小組正致力于將一個(gè)治療急性髓性白血病失敗的藥物林妥珠單抗用于AD的治療，林妥珠單抗已通過人體安全測(cè)試，有望成為AD的克星，也為AD的診斷、治療研究提供了新策略[18]。

綜上所述,AD患者外周血細(xì)胞中CD33的表達(dá)明顯高于認(rèn)知正常老年人，具有一定的臨床意義，該方法特異性高，且外周血檢查對(duì)人體傷害性低，CD33有望成為用于AD診斷的一種新的特異性明顯的生物學(xué)標(biāo)志物。但是，通過外周血檢測(cè)CD33是否能區(qū)分不同疾病程度的AD患者，特別是對(duì)于輕度認(rèn)知障礙的AD患者，是否還具有特異性仍值得探討；對(duì)于AD患者外周血中CD33表達(dá)下調(diào)的相關(guān)機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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Application of CD33 as Blood Biomarker in Alzheimer DiseaseZHULi,CHENGXu-dong,ANYan-fang.(DepartmentofGeriatrics,FirstPeople′sHospitalofXuzhou,Xuzhou221000,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the feasibility of CD33 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) as a biomarker in Alzheimer disease(AD).MethodsA total of 200 cases in Xuzhou First People′s Hospital were selected from Jan.2011 to Mar.2013,including 100 AD patients and 100 controls.CD33mRNA level was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction and the CD33positive monocytes was analyzed by flow cytometry.Pearson correlation was performed to analyze the correlation between CD33expression and Mini Mental State Examination(MMSE) score.ResultsThe expression of CD33mRNA and proportion of CD33positive monocytes were significantly decreased in AD patients compared with the controls[0.89±0.28 vs 1.06±0.33，(40±15)% vs (55±21)%，P<0.01].Regression analysis showed the expression of CD33mRNA,CD33positive monocytes had positive relationship with the MMSE score(r=0.78，0.22，P<0.05).ConclusionCD33may play an important role in the pathogenesis of AD and is feasible to serve as a blood biomarker in AD diagnosis.

Key words：Alzheimer disease; CD33; Peripheral blood mononuclear cells; Biomarker

收稿日期：2015-05-21修回日期：2015-08-04編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.069

中圖分類號(hào)：R392

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)19-3642-03