田　鯤，劉　溪，章怡葦，王愛忠

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海 200233)

水通道蛋白1在小鼠脂肪栓塞綜合征肺損傷中的作用

田鯤△，劉溪，章怡葦△，王愛忠※

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海 200233)

摘要：目的 建立脂肪栓塞綜合征(FES)肺損傷模型，探討水通道蛋白1(AQP1)在FES肺損傷發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法 ①96只健康成年雄性C57BL/6J小鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、FES 4 h組、6 h組、12 h組、24 h組和48 h組，每組16只。FES各組小鼠尾靜脈注射同種異體小鼠腎周脂肪，對照組給予相同劑量無菌生理鹽水。在相應的時間點取小鼠肺組織進行蘇木素伊紅染色，測量肺濕/干比值(W/D)變化，采用蛋白質免疫印跡法及免疫組織化學法測定AQP1的表達。②24只 C57BL/6J小鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、FES 24 h組和AQP1抑制劑組，每組8只,觀察抑制AQP1對FES肺損傷病理過程的影響。結果①FES 4 h組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組W/D值分別為5.19±0.34、5.53±0.24、5.81±0.54、5.77±0.47、5.35±0.15，均高于對照組的4.30±0.47，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組和FES組4、6、12、24、48 h的AQP1蛋白表達分別為0.85±0.25、1.00±0.30、0.98+0.39、0.66±0.20、2.02±0.65、1.26±0.35，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中FES 24 h組顯著高于對照組(P<0.05)。②FES 24 h組、抑制劑組、對照組肺組織W/D值分別為5.70±0.35、4.71±0.13、4.31±0.37，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中抑制劑組顯著低于FES 24 h組(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。結論AQP1可能在FES肺損傷的發(fā)生過程中起重要作用，抑制AQP1有助于緩解FES肺損傷導致的水腫。

關鍵詞：脂肪栓塞；肺損傷；水通道蛋白質1

脂肪栓塞綜合征(fat embolism syndrome，F(xiàn)ES)是指脂肪顆粒阻塞血管腔而引起的一系列病理生理改變的臨床綜合征，其主要癥狀為呼吸困難、低氧血癥，無頭部外傷的神經(jīng)癥狀以及皮膚黏膜出血點，其發(fā)生率主要與骨折創(chuàng)傷的嚴重程度和長骨骨折數(shù)量呈正相關[1]。由于循環(huán)的生理特點，肺微血管是脂肪栓子首先到達的部位，栓子栓塞肺部毛細血管以及小血管導致肺組織缺氧，毛細血管通透性升高，并釋放非酯化脂肪酸對肺泡細胞產(chǎn)生毒害作用引起肺水腫，患者可于早期就出現(xiàn)呼吸困難[2]。水通道蛋白對水的轉運發(fā)揮重要作用，水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)是分布于肺中的主要水通道蛋白質之一，在肺泡和毛細血管之間的液體交換中扮演著重要角色，有關AQP1在脂肪栓塞肺損傷中的研究少有報道。本研究旨在建立FES肺損傷模型，探究AQP1在FES肺損傷中的變化以及作用。

1材料與方法

1.1實驗動物SPF健康成年雄性C57BL/6J小鼠120只，體質量22～24 g，由上海西普爾必凱實驗動物公司供應，動物生產(chǎn)許可證SCXK(滬)2008-0016，上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)，動物使用許可證SYXK(滬)2011-0128，小鼠籠盒飼養(yǎng)，自由進食、飲水。

1.2FES肺損傷模型的建立及分組注射用脂肪的制備及保存參照尚嘉偉等[3]的方法。96只小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、FES 4 h組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組，每組16只。FES組均于尾靜脈注射2 μL/g脂肪，分別在注射脂肪4、6、12、24、48 h后取肺組織樣本。對照組尾靜脈給予相同體積的無菌生理鹽水。

1.3FES模型的驗證

1.3.1肺組織病理形態(tài)學檢查給予戊巴比妥麻醉小鼠后，乙醇消毒小鼠皮膚，從右心室注射無菌等滲鹽水和4%多聚甲醛灌洗肺循環(huán)及肺泡腔，取下肺組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片后蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。

1.3.2肺濕/干重比值(W/D)的測定取對照組和FES 4、6、12、24、48 h組肺組織樣本，稱量此時肺組織重量，記為濕重，將6組肺組織樣本放置于烘箱中70 ℃ 48 h后取出記錄干重，計算各組W/D值。

1.4AQP1的表達

1.4.1Western blot分析剖胸取肺組織，在冰上裂解組織后聚氰基丙烯酸正丁酯試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min后，蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜(恒流200 mA，60 min)，5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，AQP1一抗(1∶800，美國Chemicon公司，批號：121951-8)4 ℃ 搖床過夜，辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2000，美國Abcam 公司，批號：34237-11)室溫搖床孵育2 h，化學發(fā)光試劑盒顯影(美國Thermo科學公司，批號：20130930)，圖像掃描成像，以β-αctin為內參進行半定量分析。

1.4.2免疫組織化學法取肺組織，石蠟包埋切片后，脫蠟脫水，磷酸鹽緩沖液沖洗，檸檬酸鈉(pH=6)微波抗原修復，按照免疫組織化學試劑盒(Thermo公司，批號：20140219)說明，超級封閉液封閉，AQP1一抗(1∶1000，美國Chemicon公司，批號：168980-2)室溫15 min，生物素化抗體孵育，抗體效能放大試劑，二氨基聯(lián)苯胺試劑顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分色，無水乙醇脫水二甲苯透明后封片。

1.5抑制AQP1對FES肺損傷病理過程的影響24只C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、FES 24 h組、AQP1抑制劑組，每組8只。AQP1抑制劑布美他尼[4](美國Sigma公司， 28395-03-1)溶解在中NaOH溶液中，調整pH為7.5配成2.25 g/L，按0.1 mg/g腹腔注射。給予AQP1抑制劑10 min后尾靜脈注射2 μL/g脂肪，24 h后取肺組織，進行HE染色及肺組織W/D測定。

2結果

2.1脂肪栓塞小鼠的癥狀及體征健康的C57BL/6J小鼠注射同種異體脂肪后出現(xiàn)行動遲緩，反應遲鈍，不喜活動，呼吸急促，脂肪尿甚至出現(xiàn)偏癱癥狀，5只小鼠在注射數(shù)分鐘內死亡。

2.2肺組織肉眼觀以及小鼠肺病理形態(tài)正常的小鼠肺呈粉紅色，表面光滑無出血點以及水腫；FES小鼠的肺表面可見散在暗紅色梗死灶，肺水腫而變大，HE染色正常肺組織形態(tài)結構完整而FES肺組織結構紊亂，肺泡間隙增寬，炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚斷裂，肺泡腔內可見紅細胞，見封三圖1。

2.3肺組織W/D值測定對照組和FES組4、6、12、24、48 h的W/D值分別為4.30±0.47、5.19±0.34、5.53±0.24、5.81±0.54、5.77±0.47、5.35±0.15，差異有統(tǒng)計學意義(F=61.86，P<0.05)，其中FES組4、6、12、24、48 h的W/D值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4Western blot 檢測AQP1蛋白的表達對照組和FES組4、6、12、24、48 h的AQP1蛋白表達分別為0.85±0.25、1.00±0.30、0.98+0.39、0.66±0.20、2.02±0.65、1.26±0.35，差異有統(tǒng)計學意義(F=2.67，P<0.05)，其中FES 24 h 組AQP1蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見封三圖2。

2.5免疫組織化學結果AQP1主要表達于血管內皮細胞，與對照組相比FES 24 h和48 h組表達增強較顯著，見封三圖3。

圖2　水通道蛋白1(AQP1)的表達情況

2.6抑制AQP1對FES肺損傷病理過程的影響

2.6.1肺組織病理形態(tài)學檢查對照組肺組織結構完整，無炎性細胞浸入；FES 24 h組肺組織間隙增大，肺泡隔增厚斷裂，肺泡腔內可見紅細胞；AQP1抑制劑組肺組織形態(tài)較脂肪組好轉。見封三圖4。

2.6.2肺組織W/D值得測定FES 24 h組、抑制劑組、對照組肺組織W/D值分別為5.70±0.35、4.71±0.13、4.31±0.37，差異有統(tǒng)計學意義(F=56.26，P<0.05)，其中抑制劑組顯著低于FES 24 h組(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。

3討論

FES是指脂肪小滴進入循環(huán)并導致一系列癥狀和體征的臨床綜合征，常發(fā)生于長骨骨折或盆腔骨折后，下肢關節(jié)置換術后FES的發(fā)生率也較高，也可繼發(fā)于機體及其他脂肪組織的創(chuàng)傷，如抽脂，甚至與創(chuàng)傷無關，接近90%的長骨骨折和重大創(chuàng)傷患者均有脂肪栓塞，僅2%～5%的患者發(fā)展為FES[1,5]。典型的FES患者通常在傷后12～48 h內出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和腦部癥狀以及皮膚黏膜瘀斑三聯(lián)征，呼吸功能障礙常早期出現(xiàn)，癥狀輕重不等，輕者有呼吸急促、呼吸困難，重者類似急性呼吸窘迫綜合征。由于脂肪顆粒聚集于肺毛細血管以及小血管導致肺動脈高壓，同時在脂蛋白酯酶的作用脂肪酸分解下釋放出高濃度的非酯化脂肪酸，引起血小板聚集，輕微的彌漫性血管內凝血及肺毛細血管破裂，肺組織學檢查示肺泡內出血，肺泡上皮細胞受損導致肺水腫[6]。本研究中，F(xiàn)ES組W/D干濕比從4 h開始增加，說明此時肺水腫已經(jīng)出現(xiàn)，一直持續(xù)到48 h以后，48 h雖然相比24 h有所降低，但仍高于正常對照組，說明48 h后肺水腫有所好轉但卻并未完全消退。與此同時，肺組織形態(tài)學的變化過程與W/D的趨勢基本一致，注射脂肪4 h后肺泡隔已出現(xiàn)斷裂，肺組織結構紊亂，12、24 h肺泡間隔明顯增厚、斷裂，肺泡腔內可見紅細胞，48 h后肺組織結構完整性逐漸恢復，上述過程表明肺水腫是FES發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)。本實驗肺組織病理形態(tài)的結果與Inoue等[7]在大鼠模型中所得到的結論不一致，可能與本研究造模所用動物、脂肪種類以及劑量不同有關，本研究采用的是同種異體的小鼠腎周的脂肪，更接近于臨床上FES的發(fā)生。

AQP1是水通道蛋白的一個亞型，它是第1個被發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白，在紅細胞上首次被發(fā)現(xiàn)。AQP1一般以同源四聚體的形式存在于細胞膜脂質雙分子層，組成同源四聚體的每個單體均有一個獨立的水孔結構，水分子可以順著滲透梯度高速的自由通過，其轉運水分子具有雙向性[8]。AQP1與AQP5是肺中最主要的兩種水通道蛋白，AQP1位于肺微血管內皮細胞上，AQP5主要表達在Ⅰ型肺泡上皮，這兩者對血管和肺泡之間的液體轉運起最主要的作用[9-10]。本研究免疫組織化學結果顯示，AQP1在肺的微血管內皮細胞上有明顯表達，這與以往的文獻報道相似[11]，并且24 h與48 h的表達比正常對照組增強，與Western blot的結果比較一致，但與W/D的結果趨勢不同。注射脂肪4 h后W/D開始增加，但AQP1的表達變化不大，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是缺氧及早期非酯化脂肪酸等因素對細胞的毒害作用，導致細胞死亡和AQP1減少，為了代償與此同時胞質的AQP1向胞膜轉運致使AQP1的變化不明顯。隨著12 h后AQP1的表達逐漸增加直至24 h，肺水腫持續(xù)嚴重，24 h后AQP1表達下調，與此同時肺水腫的情況也有所好轉。文獻報道，AQP1敲除小鼠的離體肺中，肺泡與血管內皮細胞之間依賴滲透梯度的水通透性減少了90%，敲除AQP1可以減弱由于灌注流體靜水壓急劇增加導致的肺部水的集聚[9,12]。推測其原因可能是血管內皮AQP1減少導致由血管進入肺泡間隙的水分減少，從而減輕水腫。為了驗證這一猜想，本研究選取了AQP1表達最顯著的時間點24 h，進行抑制劑實驗，W/D和肺組織病理形態(tài)的結果顯示，在24 h給予AQP1抑制劑后，肺水腫的情況得到好轉，并且肺組織的形態(tài)也得到一定程度的恢復，表明12 h后AQP1的增加可以促進肺水腫，48 h后隨著AQP1的下調，肺水腫情況減輕，說明AQP1有可能參與FES肺損傷的恢復過程。這與King等[13]的報道相符,在缺乏AQP1的人與正常人的對照試驗中，給予相同劑量的生理鹽水后，缺乏AQP1的患者的肺泡氣道增厚程度比正常人小。

綜上所述，肺水腫是FES肺損傷過程中重要的一環(huán)，并且AQP1在肺水腫的發(fā)展過程中起到了一定作用。由于肺的水轉運涉及到多種AQPs、離子通道,AQP1與它們的協(xié)同關系以及AQP1的具體調控以及信號通路還有待研究和闡明，以便更好地了解FES肺損傷的發(fā)生過程和機制。

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Changes and Significance of Aquaporin 1 Expression in Mice Models of Fat Embolism SyndromeTIANKun，LIUXi，ZHANGYi-wei，WANGAi-zhong．(DepartmentofAnesthesiology，ShanghaiSixthPeople′sHospitalofJiaotongUniversity，Shanghai200233，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the role of aquaporin1(AQP1) in pathologic process of lung injury in mouse models of fat embolism syndrome(FES)．Methods①A total of 96 healthy male C57BL/6J mice were assigned to control group and FES group which was grouped by 4，6，12，24，and 48 hours with 16 mice per group，according to the random number table．Allogeneic perinephric fat was injected to rat caudal veins in FES groups while the control group was given the same volume of physiological saline．Lung samples were obtained from each group at different time points,to do the hematoxylin and eosin staining,and measure lung wet/dry ratio(W/D) changes.Expression of AQP1 was detected by western blot and immunohistochemistry．②Additional 24 C57BL/6J mice were divided into control group，F(xiàn)ES 24 hour group，and AQP1 inhibitor group according to the random number table，with 8 mice per group．Pathologic process of FES-induced lung injury was detected after the inhibition of AQP1．Results①Lung W/D value was 5.19±0.34,5.53±0.24,5.81±0.54,5.77±0.47,5.35±0.15 at 4，6，12，24，and 48 hours respectively， higher than 4.30±0.47 in the control group(P<0.05)．The values of expression of AQP1 in control ，4 h，6 h，12 h，24 h，48 h group were 0.85±0.25，1.00±0.30，0.98+0.39，0.66±0.20，2.02±0.65，1.26±0.35. Expression of AQP1 was at 24 hours in FES group was statistically higher than the control group(P<0.05)．②The W/D values of FES 24 hgroup,AQP1 inhibitor group,control group were 5.70±0.35,4.71±0.13，4.31±0.37，W/D value observed in AQP1 inhibitor group was statistically significantly lower than in FES 24 h group(P<0.05)，but still higher than the control group(P<0.05)．ConclusionAQP1 may play an important role in the progress of lung injury induced by FES,and inhibition of AQP1 is helpful to alleviate the edema caused by FES lung injury.

Key words：Fat embolism; Lung injury; Aquaporin 1

收稿日期：2015-05-24修回日期：2015-07-30編輯：伊姍

基金項目：國家自然科學基金(81272147)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.048

中圖分類號：R36

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4159-03