嚴曉苓，魏麗杰，王文雅，張 柳

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是老年人常見的退行性關節(jié)疾病，是軟骨細胞、細胞外基質(zhì)及軟骨下骨降解和合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果［1］。其病因及發(fā)病機制尚不清楚，但隨著信號通路在OA發(fā)病機制中的深入研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路在其發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵性作用。而MAPKs家族中的p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路則是參與此炎性反應的重要信號，外界多種應激原如細胞因子及低氧因素都可以致p38磷酸化，引起細胞內(nèi)蛋白激酶的連鎖反應［2］。在炎性反應過程中，p38MAPK作為重要的信號通路誘導基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)表達的上調(diào)，導致Ⅱ型膠原降解，加重軟骨破壞［3］。近來研究顯示，降鈣素能夠促進蛋白聚糖和Ⅱ型膠原產(chǎn)生，從而起到軟骨保護作用［4］。本實驗用白介素-1β(IL-1β)致大鼠軟骨細胞產(chǎn)生OA樣病變，給予降鈣素治療，通過蛋白免疫印跡(Western blot)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)等檢測手段探討降鈣素是否能夠減輕IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞炎性反應，從而延緩OA發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 健康1月齡SPF級SD雌性大鼠(購于河北聯(lián)合大學實驗動物中心，許可證號:2009-003);降鈣素(瑞士諾華制藥，批號:S0251)，重組人IL-1β(上海生工生物科技有限公司);小鼠抗大鼠 p38、P-p38一抗(Cell Signaling Technology公司)，兔抗大鼠Ⅱ型膠原一抗(武漢博士德公司)，小鼠抗大鼠MMP-13一抗(Millipore公司)，小鼠抗大鼠GAPDH一抗(bioss公司)，HRP標記抗小鼠、抗兔二抗(KPL);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen公司)，高速低溫離心機RT-600(Sorvall公司)，濕式轉(zhuǎn)移電泳槽、電泳儀(北京六一儀器廠)，PCR儀(MJ)。

1.2 大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)及鑒定 取大鼠8只，處死后用75%乙醇浸泡20 min。分離關節(jié)軟骨，剪碎，加入0.25% Ⅱ型膠原酶1 ml，37℃恒溫水浴箱振蕩消化8 h左右，待軟骨基本消化結(jié)束后，離心，去上清，用完全培養(yǎng)基混勻細胞后種入培養(yǎng)瓶，于5%CO2孵育箱中進行細胞培養(yǎng)。軟骨細胞密度達90%時進行傳代培養(yǎng)。將第一代融合后的軟骨細胞消化，細胞計數(shù)，按2×105/ml的密度接種于放有蓋玻片的6孔板中，進行細胞爬片培養(yǎng)，待細胞完成貼壁后，PBS沖洗3次，甲醛固定液浸泡2 h，取出放入70%乙醇中浸泡20 min，然后放于0.04%甲苯胺藍染液中2 h，用無水乙醇快速漂洗，二甲苯透明，封片，光鏡下觀察。

1.3 實驗分組 將二代細胞分為空白對照組、IL-1β誘導組、IL-1β+降鈣素治療組，給藥方法:空白對照組給予DMEM/F12完全培養(yǎng)基;IL-1β誘導組給予含10 ng/ml IL-1β的DMEM/F12完全培養(yǎng)基;IL-1β+降鈣素治療組給予含10 ng/ml IL-1β的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導15 min后，加50 ng/ml降鈣素。3組均培養(yǎng)24 h。

1.4 透射電鏡 取已加藥的軟骨細胞每組6瓶，生理鹽水沖洗3次，每瓶加1 ml胰酶消化，將消化下來的細胞1000 r/min離心8 min，倒掉上清，PBS沖洗，1000 r/min離心8 min，去上清，重復2次，用2.5%戊二醛固定細胞團。送檢后透射電鏡觀察，并采集圖像。

1.5 Western blot檢測 提取軟骨細胞總蛋白，按照BCA法測濃度試劑盒要求測定蛋白濃度。用裂解液將蛋白樣品的濃度調(diào)一致，加入上樣緩沖液，沸水中煮5 min使蛋白變性。灌膠，充分凝固后在電泳槽中加電泳緩沖液，蛋白樣品加熱離心后每孔上樣15 μl，上樣量為50 μg，加入標準蛋白 Marker，邊緣孔加入等量上樣緩沖液。電泳完畢后進行濕轉(zhuǎn)，根據(jù)蛋白分子量的大小在適當時間取出條帶用TBST 洗10 min，將抗 MMP-13、p38、P-p38、Ⅱ型膠原一抗參照說明書進行稀釋，孵一抗4℃過夜。次日用TBST洗膜10 min×3次后加入HRP標記山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗(1∶5000稀釋)37℃孵育2 h，用TBST洗膜10 min×3次，將 PVDF膜甩干，配ECL顯色劑進行顯色。利用Image J圖像處理軟件對掃描的條帶進行分析，測定其灰度值，最終以各目的蛋白所得的灰度值分別與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為結(jié)果，進行統(tǒng)計學分析。

1.6 實時熒光定量PCR 用Trizol提取軟骨細胞總RNA，RNA純度測定后進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應總體積為20μl，隨機寡核苷酸引物1μl，2μg總RNA(加入量根據(jù)RNA濃度計算得到)，用RNase Free dH2O將體系調(diào)至12μl，70℃孵育5 min。之后在冰上操作，在上述反應液中加入5×reaction buffer 4μl，RNase inhibitor 1 μl，dNTP mix 2 μl，振蕩混勻后，離心5000 r/min 10 s，然后在37℃環(huán)境孵育5 min，結(jié)束后加入M-MuLVRT逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，37℃孵育60 min，70℃加熱10 min停止反應。PCR反應體系:總體積25 μl，dNTP 0.5 μl，10 ×Buffer 2.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，Taq 酶1 μl，用 RNase Free dH2O補足到25μl，將配制好的反應體系放入PCR儀中，按設定好的程序進行擴增，95℃ 15 s，58℃ 20 s，40個循環(huán)，引物序列見表1。

表1 基質(zhì)金屬蛋白酶-13、Ⅱ型膠原、GAPDH引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞 甲苯胺藍染液對第一代軟骨細胞進行染色，可見軟骨細胞胞漿和細胞外基質(zhì)經(jīng)染色后呈異染性，為紫紅色，細胞核被染成深藍色，核仁為紫藍色，證明培養(yǎng)的細胞是軟骨細胞，見圖1。

圖1 軟骨細胞甲苯胺藍染色A.×400;B.×600

2.2 軟骨細胞超微結(jié)構(gòu)的改變 透射電子顯微鏡觀察，空白對照組中正常軟骨細胞細胞膜光滑，且表面有許多突起和皺褶，胞質(zhì)豐富，細胞器如線粒體，高爾基體多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無腫脹，核膜光滑。IL-1β誘導組可明顯觀察到軟骨細胞的損傷，細胞膜表面的突起和皺褶幾乎消失，胞質(zhì)內(nèi)存在大量的空泡，線粒體數(shù)目減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。IL-1β+降鈣素治療組軟骨細胞呈現(xiàn)不同程度的損傷，細胞膜表面的突起和皺褶較空白對照組相對稀疏，細胞內(nèi)線粒體數(shù)目減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有輕微的腫脹，但是與IL-1β誘導組比較，軟骨細胞損傷程度較輕，見圖2。

圖2 3組大鼠軟骨細胞顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡×15 000)A.空白對照組;B.白介素-1β誘導組;C.白介素-1β+降鈣素治療組

2.3 Western blot檢測結(jié)果 將3組目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為其相對表達值，進行統(tǒng)計分析。3組p38的蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);IL-1β誘導組和IL-1β+降鈣素治療組P-p38、MMP-13蛋白表達水平均高于空白對照組，且IL-1β+降鈣素治療組低于 IL-1β誘導組(P＜0.05);Ⅱ型膠原蛋白表達水平IL-1β誘導組和IL-1β+降鈣素治療組低于空白對照組(P＜0.05)，IL-1β+降鈣素治療組高于IL-1β誘導組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2，圖3～5。

表2 3組大鼠軟骨細胞目的蛋白表達水平(x±s)

圖3 3組大鼠軟骨細胞p38和P-p38蛋白表達

圖4 3組大鼠軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-13蛋白表達

圖5 3組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白表達

2.4 實時熒光定量PCR結(jié)果 將3組中MMP-13、Ⅱ型膠原基因 mRNA的相對拷貝數(shù)(ΔCT值)與GAPDH基因的ΔCT比作為其相對表達量，對所得比值進行統(tǒng)計學分析。MMP-13 mRNA表達IL-1β誘導組和IL-1β+降鈣素治療組高于空白對照組，而IL-1β+降鈣素治療組低于IL-1β誘導組(P＜0.05);Ⅱ型膠原mRNA的表達IL-1β誘導組和IL-1β+降鈣素治療組低于空白對照組(P＜0.05)，IL-1β+降鈣素治療組較IL-1β誘導組升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 3組大鼠軟骨細胞MMP-13、Ⅱ型膠原基因mRNA相對表達量(x±s)

3 討論

OA是最常見的關節(jié)炎癥，其以關節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征。OA多發(fā)生于中年以上人群，其發(fā)病率隨著年齡增加而升高［5］。OA病因復雜，發(fā)病機制至今尚不清楚，近年來研究表明細胞外基質(zhì)的合成與降解失衡是OA的一個重要特征［6］。在受累關節(jié)，炎性因子、生長因子等通過與細胞膜上的受體結(jié)合激活細胞內(nèi)的MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路引起MMPs表達增加、軟骨細胞凋亡、軟骨破壞等一系列反應［7］。MMPs是一組Zn依賴性內(nèi)肽酶，可降解細胞外基質(zhì)中的膠原、蛋白多糖以及其他的細胞外基質(zhì)分子，在膝關節(jié)OA發(fā)生、發(fā)展中起重要病理作用，并最終導致關節(jié)畸形［8］。IL-1是參與MMPs引起的關節(jié)軟骨損傷過程中重要的致炎因子。本研究通過查閱相關文獻并參照之前的研究，將體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞用10 ng/ml IL-1β誘導經(jīng)Western blot和實時熒光定量PCR檢測分析后發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比MMP-13表達顯著升高，Ⅱ型膠原的表達顯著降低，因此，用IL-1β誘導并模擬OA條件下的軟骨細胞進行后續(xù)實驗是可行的。

研究證實，在炎癥過程中p38MAPK作為重要的信號通路使MMP-13表達上調(diào)，導致Ⅱ型膠原進行性降解，軟骨損傷［3］，雖然這種改變涉及多條信號轉(zhuǎn)導通路(如 NF-κB、JAK-STAT)的參與，但p38MAPK信號通路卻起著關鍵性作用［9-10］。研究證實，OA患者MMP-13表達增加。MMP-13是軟骨Ⅱ型膠原的主要降解酶，p38絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導途徑參與這一過程［11］。在體外培養(yǎng)的單層細胞中，封鎖p38信號通路能夠抑制軟骨細胞去分化為成纖維細胞，促進軟骨組織的再生［12］，從而證實了p38信號通路在炎性反應中起作用。

降鈣素是治療骨質(zhì)疏松癥及高鈣血癥的常用藥物，隨著對其研究的深入，證明降鈣素具有軟骨保護作用。Sondergaard等［13］證實了關節(jié)軟骨細胞上有功能性降鈣素受體的存在，表明降鈣素對軟骨細胞有直接作用。李彬等［14］研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素使OA軟骨細胞Ⅱ型膠原表達上調(diào)，而抑制MMP-13表達。本研究結(jié)果顯示，與IL-1β誘導組比較，IL-1β+降鈣素治療組MMP-13表達降低，透射電鏡結(jié)果也提示IL-1β+降鈣素治療組軟骨細胞OA改變較IL-1β誘導組減輕，提示降鈣素對OA關節(jié)軟骨細胞具有一定保護作用。表明降鈣素可能通過抑制p38信號通路激活降低MMP-13表達，進而減少MMP-13對Ⅱ型膠原降解，在一定程度抑制OA軟骨細胞炎性反應，起到保護軟骨細胞作用。本研究結(jié)果還顯示，IL-1β+降鈣素治療組Ⅱ型膠原的表達雖有升高趨勢，但與IL-1β誘導組比較差異無統(tǒng)計學意義。用實時熒光定量PCR從基因水平檢測MMP-13和Ⅱ型膠原表達情況，與Western blot結(jié)果一致。分析原因可能是由于還有其他信號轉(zhuǎn)導通路對Ⅱ型膠原降解起作用，也可能因IL-1β作用時間過長或降鈣素作用時間不足，今后實驗方向可以在更多時間點增加通路抑制劑對其加以研究。近期研究表明，給予特異性通路阻斷劑調(diào)控p38MAPK的表達和活化成為急性炎性反應的一條新途徑。p38阻斷劑的應用可對骨關節(jié)炎起重要保護作用［15］。應用p38通路抑制劑SB203580可以抑制炎性因子(如COX-2、PGE2、iNOS)的產(chǎn)生及MMP-13表達，阻止細胞外基質(zhì)降解［16］，為今后對通路的深入研究提供方向。

綜上所述，IL-1β誘導的軟骨細胞中 P-p38、MMP-13的表達顯著增加，Ⅱ型膠原的表達降低，提示IL-1β具有損傷軟骨細胞的作用，其誘導后的軟骨細胞作為OA軟骨細胞進行實驗可行。在IL-1β誘導的OA軟骨細胞中，降鈣素能顯著下調(diào)MMP-13的表達，上調(diào)Ⅱ型膠原的表達，在一定程度表明降鈣素能對OA軟骨細胞的損傷起到一定的抑制作用從而保護軟骨。此外，降鈣素能下調(diào)IL-1β誘導的OA軟骨細胞中P-p38的水平，提示降鈣素能抑制IL-1β誘導的p38信號通路的表達。

盡管目前對降鈣素具體作用機制尚未完全闡明，甚至有些學者對降鈣素治療OA存在疑問，但本實驗結(jié)果能夠部分說明降鈣素能抑制IL-1β誘導的關節(jié)軟骨細胞中p38信號通路的激活，從而抑制MMP-13的產(chǎn)生，減少MMP-13對Ⅱ型膠原的降解，改善OA軟骨細胞的炎性反應，對軟骨細胞起到一定的保護作用，減輕軟骨損傷，延緩病程。因此，降鈣素可以作為一種輔助治療方法開展進一步的基礎及臨床研究。

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