楊 勇，曹 政，佟新竹，羅 濤，謝華強，吳瑞霞

內(nèi)皮細胞在動脈粥樣硬化危險因素作用下，血管收縮因子內(nèi)皮素-1(ET-1)釋放增加，舒張血管物質(zhì)一氧化氮(NO)釋放減少，作用于血管基底膜的平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞，促進斑塊內(nèi)血管新生、纖維膜溶解［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases，MMP-9)是影響粥樣斑塊穩(wěn)定性的主要基質(zhì)蛋白酶，與金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)平衡紊亂后，可導致斑塊纖維帽變薄，動脈粥樣硬化斑塊破裂［2］。多項研究使用小分子干擾RNA(siRNA)作用于動脈粥樣硬化的多個靶點，觀察其對動脈粥樣硬化的發(fā)生和進程均有顯著影響［3-4］。我們以往的研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)-siRNA轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)株CRL-1730，證實其能夠特異性的沉默內(nèi)皮細胞ACE表達，也觀察到ACE-siRNA可調(diào)節(jié)ET-1表達［5］。但前期研究以內(nèi)皮細胞株為研究對象，不清楚其對于原代內(nèi)皮細胞是否有相同作用，也未闡明 ACE-siRNA對內(nèi)皮細胞 MMP-9與TMIP-1表達的影響。本研究以體外培養(yǎng)HUVECs為研究對象，將ACE-siRNA轉(zhuǎn)染入細胞，驗證其對ACE mRNA和蛋白表達的沉默效應，觀察其對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導刺激的內(nèi)皮細胞 MMP-9/TMIP-1、ET-1/NO表達的影響，探討ACE-siRNA作為動脈粥樣硬化斑塊干預治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 LipofectamineTM2000、Trizol試劑(Invitrogen，USA);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，Lithuania);AngⅡ(Sigma，USA)。兔抗MMP-9多克隆抗體(Santa Cruz，USA);兔抗TIMP-1多克隆抗體(Bioworld Technology，USA);HRP標記的羊抗兔IgG抗體(Pierce，USA)。特異性沉默人ACE mRNA(Genbank，編號:NM_000789.2)的siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司合成)，作用靶序列為5＇-GCATCACCAAGGAGAACTA-3＇。

1.2 HUVECs培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 按照我們以往發(fā)表的文獻中培養(yǎng)原代HUVECs的方法［6］，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)原代 HUVECs，傳代后用含 10%胎牛血清的DMEM調(diào)節(jié)密度至108/L種細胞于6孔板中。培養(yǎng)48 h至細胞融合30% ～50%后，換無血清培養(yǎng)液并使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA進入細胞。藍色激光激發(fā)FAM熒光，拍攝熒光圖片。于轉(zhuǎn)染后24和48 h提取細胞總RNA和總蛋白，檢測ACE mRNA及蛋白表達驗證沉默效率。

1.3 實驗分組及方法 實驗分為正常對照組，不加任何藥物;AngⅡ組，加入AngⅡ作用24 h，終濃度為1×10-7mmol/L，不進行轉(zhuǎn)染;AngⅡ刺激聯(lián)合ACE-siRNA轉(zhuǎn)染組(AngⅡ +siRNA組)，轉(zhuǎn)染入 ACE-siRNA 80 nmol/L并加入AngⅡ作用24 h，終濃度為1×10-7mmol/L。轉(zhuǎn)染siRNA的心肌細胞在轉(zhuǎn)染后24 h加入10-7mmol/L AngⅡ，繼續(xù)作用至轉(zhuǎn)染后48 h用于后續(xù)檢測。每孔重復3孔。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測ACE、MMP-9、TIMP-1 mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA，取1μg按照試劑盒說明書合成cDNA并作為模板行PCR擴增。ACE引物序列:上游5＇-CCCTCTACCTGAACCTCCA-3 ＇， 下 游 5 ＇-GACCTTCCCAGAACTCG-3＇，擴增片段 292 bp。MMP-9 引物序列:上 游 5 ＇-TACCAGCTACTCGGGAGG-3 ＇，下 游 5 ＇-GCATCGGGCAGGGTCTAT-3 ＇，擴 增 片 段 220 bp。TIMP-1 引物序列:上游 5＇-CCAGAAATCAACGAGACCACC-3＇，下游 5＇-TACGCCAGGGAACCAAGAAG-3＇，擴增片段 241 bp。GAPDH引物序列:上游 5＇-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3 ＇，下 游 5 ＇-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3＇，擴增片段 496 bp。以GAPDH為內(nèi)參，PCR反應條件為94℃ 3 min，94℃30 s，解鏈溫度 30 s，72℃ 1 min，循環(huán) 30 次，最后72℃ 延伸10 min。循環(huán)35次，ACE、MMP-9、TIMP-1、GAPDH 退火溫度分別為 56、53、56、58℃。產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。用ACE、MMP-9、TIMP-1的條帶灰度值與GAPDH的條帶灰度值的比值代表 ACE、MMP-9、TIMP-1的相對含量。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)法測定 ACE、MMP-9、TIMP-1蛋白表達 RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白。按照產(chǎn)品說明書完成Western blot操作。根據(jù)Marker判斷顯像蛋白大小。

1.6 用硝酸還原酶法進行NO濃度測定 NO在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)為NO2-、NO3-，NO2-進一步轉(zhuǎn)化為NO3-。用硝酸還原酶特異性將 NO3-還原為NO2-，550 nm波長測樣品吸收值。NO(μmol/L)=(樣品管吸光度 -空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×100×樣品稀釋倍數(shù)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定ET-1濃度凍存標本復溶并置于冰浴中，按照產(chǎn)品說明書步驟完成一抗、二抗孵育及生物素反應、顯色操作，用酶標儀在450 nm波長處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔光密度(OD)值;Excel軟件繪制散點圖計算標準曲線，根據(jù)各孔OD值計算樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，組內(nèi)比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)的HUVECs 傳代培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡(10×10)觀察可見細胞形態(tài)呈現(xiàn)梭形或鋪路石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚。見圖1。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染后24、48 h ACE mRNA和蛋白表達 轉(zhuǎn)染24 h后，在激光共聚焦顯微鏡的藍光激發(fā)狀態(tài)下，可見綠色熒光在視野下成簇分布;與同一視野下明場細胞照片融合后發(fā)現(xiàn)綠色熒光主要分布在細胞胞漿中，證實siRNA成功轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。見圖2。與轉(zhuǎn)染前比較，ACE siRNA轉(zhuǎn)染后24 h ACE mRNA和蛋白的表達無明顯下降(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染后48 h ACE mRNA和蛋白的表達均下調(diào)(P＜0.05)，mRNA下調(diào)比例達到52.5%，蛋白下調(diào)比例達51%，見表1、圖3。

圖1 原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞顯微鏡下形態(tài)(10×10)圖2 轉(zhuǎn)染后人臍靜脈內(nèi)皮細胞熒光顯微鏡下形態(tài)(40×10)A.常規(guī)視野;B熒光激發(fā);C.A和B融合

表1 ACE-siRNA轉(zhuǎn)染前后ACE mRNA和蛋白表達(x ± s，n=3)

2.3 MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表達 AngⅡ組MMP-9 mRNA和蛋白表達較正常對照組明顯增加，AngⅡ+siRNA組MMP-9 mRNA和蛋白表達較AngⅡ組明顯下降(P＜0.05);3組TIMP-1 mRNA和蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);MMP-9/TIMP-1 mRNA和蛋白表達的比例AngⅡ組顯著高于對照組，AngⅡ+siRNA組顯著低于AngⅡ 組(P ＜0.05)。見表2，圖4～5。

2.4 ET-1和NO表達 與正常對照組比較，AngⅡ組ET-1表達明顯增加，NO表達減少(P＜0.05);與AngⅡ組比較，AngⅡ+siRNA組ET-1表達下調(diào)，NO表達增加(P＜0.05)。見表3。

圖3 ACE-siRNA對ACE mRNA及蛋白表達影響ACE為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶;A.ACE-siRNA;B.ACE蛋白

表2 3組人臍靜脈內(nèi)皮細胞MMP-9、TIMP-1 mRNA及蛋白表達及其比值(x ± s，n=3)

圖4 3組人臍靜脈內(nèi)皮細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9 mRNA和蛋白表達比較MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9;AngⅡ為血管緊張素-2;A.MMP-9 mRNA;B.MMP-9蛋白

圖5 3組人臍靜脈內(nèi)皮細胞金屬蛋白酶組織抑制劑-1 mRNA和蛋白表達比較TIMP-1為金屬蛋白酶組織抑制劑-1，AngⅡ為血管緊張素-2;A.TIMP-1 mRNA;B.TIMP-1

表3 3組人臍靜脈內(nèi)皮細胞一氧化氮、血管收縮因子內(nèi)皮素-1的表達(x ± s，n=3)

注:AngⅡ為血管緊張素2;與正常對照組比較，aP＜0.05;與AngⅡ組比較，cP＜0.05

3 討論

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的關鍵酶，是冠狀動脈粥樣硬化的重要治療靶點［7］。RNA干擾是基因沉默技術的常用手段［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在 AngⅡ作用下，HUVECs MMP-9表達增加，MMP-9/TIMP-1比例增高;同時ET-1表達增加，NO表達下調(diào)。而利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將ACE-siRNA轉(zhuǎn)染入HUVECs，能夠在轉(zhuǎn)染后48 h下調(diào)ACE基因及蛋白水平的表達，沉默效率＞50%。同時觀察到HUVECs MMP-9表達明顯減少，MMP-9/TIMP-1比例下降;NO表達增加，ET-1表達顯著下調(diào)。提示ACE-siRNA可通過沉默ACE表達影響HUVECs ET-1、NO的表達，調(diào)整AngⅡ誘導下的HUVECs MMP-9/TIMP-1比例失衡。這一結果與Kojima等［9］的研究結果相似。其原因涉及 RAAS系統(tǒng)多個調(diào)控途徑，研究已證實Ang1-7肽主要由AngⅡ經(jīng)ACE2分解產(chǎn)生，其可激活內(nèi)皮細胞表面Mas受體;Ang1-7肽最終由ACE水解成無活性的肽分子［10］。Zhong等［11］發(fā)現(xiàn)隨著 ACE 表達下調(diào)，AngⅡ表達明顯增加，可促進AngⅡ向Ang1-7肽轉(zhuǎn)化;而Ang1-7肽與內(nèi)皮細胞表面Mass受體結合可降低炎性相關核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活性，且Ang1-7肽濃度增加后也可促進緩激肽生成［12］，從而促進內(nèi)皮細胞釋放NO，抑制ET-1釋放，發(fā)揮改善內(nèi)皮功能作用［13］。隨著ACE沉默，ACE對緩激肽的降解減少，緩激肽通過緩激肽B1型受體系統(tǒng)及促進內(nèi)皮細胞釋放NO參與內(nèi)皮細胞功能調(diào)節(jié)［14］。MMP-9以Zn2+為輔助因子，包括NF-κB和SP1結合位點，隨著NF-κB下調(diào)，MMP-9 mRNA和蛋白合成和釋放均下調(diào)，進而調(diào)節(jié) MMP-9/TIMP-1 比例［15-17］。

因此，ACE-siRNA作為HUVECs內(nèi)ACE的特異性沉默工具，可有效沉默原代HUVECs ACE表達，調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1表達和ET-1/NO表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能及改善動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用，可作為動脈粥樣硬化的治療靶點進一步研究。

［1］ Madden JA.Role of the vascular endothelium and plaque in acute ischemic stroke［J］.Neurology，2012，79(13 Suppl 1):S58-S62.

［2］ Su W，Gao F，Lu J，et al.Levels of matrix metalloproteinasE-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 mRNAs in patients with primaryhypertension or hypertensioninduced atherosclerosis［J］.J Int Med Res，2012，40(3):986-994.

［3］ Johnson J L，Dwivedi A，Somerville M，et al.Matrix metalloproteinase(MMP)-3 activates MMP-9 mediated vascular smooth muscle cell migration and neointima formation in mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31(9):e35-e44.

［4］ Guo T，Wang J，Yang J，et al.Lentivirus-mediated RNA interference of chymase increases the plaque stability in atherosclerosis in vivo［J］.Exp Mol Pathol，2013，95(1):51-56.

［5］ 楊勇，王瑋，黃從新，等.ACE siRNA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞ET-1表達的影響［J］.鄖陽醫(yī)學院學報，2009，28(2):109-112，封 2.

［6］ 王燕，王君，龔堅，等.兩種人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法的比較［J］.中外醫(yī)學研究，2013(2):38-39.

［7］ Saha S A.Angiotensin-receptor blockers for the management of hypertension:new insights，new challenges［J］.South Med J，2010，103(7):599-600.

［8］ Bhindi R，F(xiàn)ahmy R G，Lowe H C，et al.Brothers in arms:DNA enzymes，short interfering RNA，and the emerging wave of small-molecule nucleic acid-based genE-silencing strategies［J］.Am J Pathol，2007，171(4):1079-1088.

［9］ Kojima C，Ino J，Ishii H，et al.MMP-9 inhibition by ACE inhibitor reduces oxidized LDL-mediated foam-cell formation［J］.J Atheroscler Thromb，2010，17(1):97-105.

［10］ Iwanami J，Mogi M，Tsukuda K，et al.Role of angiotensin-converting enzyme 2/angiotensin-(1-7)/Mas axis in the hypotensive effect of azilsartan［J］.Hypertens Res，2014，37(7):616-620.

［11］Zhong J，Basu R，Guo D，et al.Angiotensin-converting enzyme 2 suppresses pathological hypertrophy，myocardial fibrosis，and cardiac dysfunction［J］.Circulation，2010，122(7):717-728.

［12］Raffai G，Khang G，Vanhoutte P M.Angiotensin-(1-7)augments endothelium-dependent relaxations of porcine coronary arteries to bradykinin byinhibiting angiotensinconverting enzyme 1［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2014，63(5):453-460.

［13］ Gauthier K M，Cepura CJ，Campbell W B.ACE inhibition enhances bradykinin relaxations through nitric oxide and B1 receptor activation in bovinecoronary arteries［J］.Biol Chem，2013，394(9):1205-1212.

［14］ Dzau V J，Bernstein K，Celermajer D，et al.Pathophysiologic and therapeutic importance of tissue ACE:a consensus report［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2002，16(2):149-160.

［15］Podesser B K，Siwik D A，Eberli F R，et al.ET(A)-receptor blockade prevents matrix metalloproteinase activation late postmyocardial infarction in the rat［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280(3):H984-H991.

［16］楊麗娟，游育紅，林志彬，等.靈芝多糖肽對人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):657-660.

［17］周曦，易龍，金鑫，等.SIRT1/UCP2通路在白藜蘆醇抑制血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷中的作用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2013，35(16):1671-1675.