趙書云，趙 潔，劉 杰，呂玉琴，張海霞，李 晗，谷凌云，郭漢斌，曹建彪

肝細(xì)胞癌(hepatic carcinoma，HCC)是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病死率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌［1-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新患HCC人數(shù)為62.6萬(wàn)人，死亡人數(shù)則高達(dá)59.8萬(wàn)人，新發(fā)HCC病例中55%發(fā)生于中國(guó)［4］。循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)充分表明，早期診斷HCC并給予有效的治療將會(huì)明顯延長(zhǎng)生存期［5］。腫瘤標(biāo)志物血清學(xué)檢測(cè)已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤早期診斷、預(yù)后判定和療效評(píng)價(jià)等方面，而新腫瘤標(biāo)志物研究已成為全球的熱點(diǎn)。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)HCC患者血清中胰蛋白酶原-2(Try-2)含量，探討其用于HCC診斷的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年6—12月北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍肝病治療中心收治的經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)確診為HCC 34例，均符合2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》診斷標(biāo)準(zhǔn):發(fā)?。?年，未經(jīng)藥物及手術(shù)治療。男22例，女12例;平均年齡58.2歲。選擇同期經(jīng)超聲、CT等診斷的發(fā)?。?年、未經(jīng)藥物系統(tǒng)治療的乙型肝炎肝硬化30例，男19例，女11例;平均年齡61.9歲。選擇同期診斷為慢性乙型肝炎者30例，男20例，女10例;平均年齡51.6歲。以上病例均無(wú)明顯上消化道癥狀及胰腺疾病病史，無(wú)嚴(yán)重心、肺、肝、腎和神經(jīng)、精神疾病等，并排除孕婦、酗酒者、藥物成癮者。3種疾病患者性別、年齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 所有研究對(duì)象留置空腹靜脈全血4 ml，標(biāo)本當(dāng)日或于2～8℃冷藏保存至次日離心后取上清液分裝置于-70℃凍存，統(tǒng)一采用ELISA法定量檢測(cè)血清中Try-2的含量。血清Try-2檢測(cè)試劑盒由上海卡努生物技術(shù)有限公司提供，采用美國(guó)BIORAD Model550酶標(biāo)儀分析，試驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。應(yīng)用受試者操作特征曲線(ROC)確定檢測(cè)指標(biāo)的臨界值并對(duì)其進(jìn)行診斷效率評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 血清Try-2濃度 HCC、乙型肝炎肝硬化和慢性乙型肝炎血清Try-2含量分別為(12.86±3.90)、(8.30±1.22)及(5.70±2.15)μg/L。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，故分別計(jì)算出其中位數(shù)、四分位間距、全距，三者血清Try-2含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Chi-Square值為12.443，P＜0.05)。其中兩兩比較血清Try-2含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 3種疾病血清胰蛋白酶原-2含量(μg/L)

2.2 血清Try-2鑒別HCC、慢性乙型肝炎R(shí)OC曲線 用血清Try-2鑒別HCC、慢性乙型肝炎的cut-off值，得出最佳臨界值為7.30μg/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為89.11%和81.32%。血清Try-2 ROC曲線下面積小于AFP，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見圖 1，表 2。

圖1 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鑒別肝細(xì)胞癌和慢性乙型肝炎的ROC曲線

表2 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鑒別肝細(xì)胞癌和慢性乙型肝炎R(shí)OC曲線下面積

2.3 血清Try-2鑒別HCC、乙型肝炎肝硬化的ROC曲線 HCC血清Try-2含量高于乙型肝炎肝硬化，設(shè)定敏感度最低限值為80%，尋找不低于該限值的最大特異度的切點(diǎn)作為最佳工作點(diǎn)。用血清Try-2鑒別HCC、慢性乙型肝炎的cut-off值，得出最佳臨界值為8.18μg/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為85.30%和63.32%。血清Try-2 ROC曲線下面積小于AFP，差異顯著(P＜0.05)。見圖2，表3。

圖2 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鑒別肝細(xì)胞癌和慢性乙型肝炎的ROC曲線

表3 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鑒別肝細(xì)胞癌和慢性乙型肝炎R(shí)OC曲線下面積

3 討論

胰蛋白酶原是胰蛋白酶的前體，是一種分子量為25 kD的蛋白酶，其由兩種同工酶組成，包括Try-1(陽(yáng)離子型)和Try-2(陰離子型)兩種亞型，除分布于人類皮膚、消化道、肺、腎、肝和膽管的上皮細(xì)胞外，在一些腫瘤細(xì)胞中胰蛋白酶原也存在較高表達(dá)，如胰腺癌、膽管癌、卵巢腫瘤、胃癌、結(jié)直腸腫瘤等［6-7］。在許多惡性腫瘤及培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)的Try-2稱為腫瘤相關(guān)性Try-2，經(jīng)氨基酸測(cè)序檢測(cè)，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Try-2與胰腺腺泡細(xì)胞分泌Try-2 序列相同［8-9］。

Try-2可直接或間接引起腫瘤周圍基質(zhì)蛋白水解而形成腫瘤侵襲，活化后Try-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)，且能作為一種生長(zhǎng)刺激因子，激活受體-2，促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。正常情況下，血液中只有少量Try-2表達(dá)，當(dāng)受體某些組織受到惡性腫瘤破壞時(shí)，Try-2大量入血，血中Try-2含量明顯升高［10］。本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清中的Try-2含量高于慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者，與前述報(bào)道相似。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于Try-2與HCC及肝硬化的關(guān)系尚無(wú)較明確的研究，其判斷臨界值也存在較大差異，Itkonen［11］和 Largman 等［12］采用放射免疫法檢測(cè)正常組血清Try-2含量均值分別為17.0和4.5μg/L，而Kimland等［13］采用 ELISA檢測(cè)血清 Try-2均值為21μg/L，這可能與標(biāo)準(zhǔn)化抗原的制備、檢測(cè)方法、人群種族、年齡、性別等因素有關(guān)。

迄今為止，血清AFP仍是臨床檢測(cè)HCC時(shí)使用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物之一，其在臨床應(yīng)用時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)方法成熟、簡(jiǎn)便，在高危人群篩查方面有一定的優(yōu)勢(shì)，但也存在著許多不足，如特異度和靈敏度的問題［14］，當(dāng)AFP診斷閾值設(shè)定為20μg/L時(shí)，其診斷預(yù)測(cè)靈敏度為67.2%，而特異度為29.2%;當(dāng)AFP診斷閾值設(shè)定為400μg/L時(shí)，其診斷預(yù)測(cè)靈敏度太低(42.8%)而無(wú)法在臨床使用［15-17］。本研究繪制的血清Try-2鑒別診斷HCC和慢性乙型肝炎R(shí)OC曲線時(shí)，得出最佳臨界值為7.30μg/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為89.11%和81.32%，提示此臨界值兼顧了靈敏度和特異度。在鑒別診斷HCC與乙型肝炎肝硬化時(shí)，需要較高的靈敏度，以便篩查HCC進(jìn)行下一步診治，故設(shè)最低靈敏度為80%，選取不低于該限值的最大特異度的切點(diǎn)，最佳臨界值為8.18μg/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為85.30%和63.32%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)血清Try-2＞7.30μg/L時(shí)，應(yīng)考慮可能存在肝臟疾患，而當(dāng)Try-2＞8.18μg/L時(shí)，患HCC的可能性較大，應(yīng)給予進(jìn)一步影像學(xué)等檢查以明確診斷，或密切隨訪。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，血清Try-2異常增高亦可存在于多種腫瘤組織［6-7］，也應(yīng)注意結(jié)合臨床表現(xiàn)或特異性檢查，以便與HCC鑒別。

無(wú)論鑒別HCC與慢性乙型肝炎，還是HCC與乙型肝炎肝硬化，血清Try-2 ROC曲線下面積均小于AFP。血清Try-2與優(yōu)化后AFP比較，其診斷效率都不優(yōu)于AFP，其中鑒別HCC與慢性乙型肝炎時(shí)差異不顯著，而在鑒別HCC與肝硬化時(shí)差異顯著。

綜上所述，血清Try-2與HCC具有良好相關(guān)性，其ELISA檢測(cè)可作為一種非侵入性的初篩試驗(yàn)，其檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，對(duì)HCC具有較好的靈敏度和特異度，或可作為平行指標(biāo)彌補(bǔ)其他腫瘤標(biāo)志物，對(duì)臨床初篩HCC有一定的價(jià)值。

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