何傳新，任圣穎，謝敏隨，袁安朋，洪 飛，張黔玲，劉劍洪

深圳大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，深圳 518060

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【材料科學(xué) / Material Science】

基于Fe3O4-PEI納米粒子構(gòu)建葡萄糖傳感器的研究

何傳新，任圣穎，謝敏隨，袁安朋，洪 飛，張黔玲，劉劍洪

深圳大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，深圳 518060

采用共沉淀法制備核層為四氧化三鐵(Fe3O4)殼層為聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)的磁性復(fù)合納米粒子Fe3O4-PEI．掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡表征結(jié)果顯示，制備的磁性復(fù)合納米粒子Fe3O4-PEI粒徑均勻，直徑約為25 nm. 通過振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)比較Fe3O4-PEI和Fe3O4納米粒子的磁滯回線，結(jié)果表明，經(jīng)PEI包覆后復(fù)合納米粒子飽和磁化值為38.2 emu/g，仍具有較好的磁性. 熱重分析表明，包覆在Fe3O4納米粒子表面的PEI質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為23.26%．通過靜電作用，實(shí)現(xiàn)了Fe3O4-PEI復(fù)合納米粒子對(duì)葡萄糖氧化酶的負(fù)載，以鉑電極為基底電極，制備了Fe3O4-PEI-GOx/Pt葡萄糖傳感器. 在最優(yōu)測(cè)試條件下，該修飾電極對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)催化性能，具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)．

高分子化學(xué)；葡萄糖傳感器；磁性納米粒子；聚乙烯亞胺，葡萄糖氧化酶，靜電作用

自1956年Clark提出氧電極與酶的電化學(xué)反應(yīng)理論以來，經(jīng)科學(xué)家長(zhǎng)期不懈地努力，葡萄糖酶?jìng)鞲衅饕讶〉瞄L(zhǎng)足發(fā)展[1]．一般來講，葡萄糖酶?jìng)鞲衅骶哂羞x擇性好[2-3]和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，但由于其所負(fù)載的葡萄糖氧化酶易受pH值和溫度等外界環(huán)境的影響而降低或喪失活性，從而導(dǎo)致該類型電極穩(wěn)定性差[6-7]．

磁性納米粒子具有良好的生物相容性、磁導(dǎo)向性和磁場(chǎng)響應(yīng)性等性能，在核磁共振成像、藥物的緩釋、標(biāo)記DNA和蛋白質(zhì)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8-10]. 在有酶型葡萄糖傳感器的制備上，需借助載體將葡萄糖氧化酶修飾到電極界面.如何在載體上盡可能多的負(fù)載葡萄糖氧化酶，并保留酶的活性，是提高葡萄糖傳感器綜合性能的一個(gè)關(guān)鍵因素．利用Fe3O4磁性納米粒子負(fù)載葡萄糖氧化酶，不僅使制備的葡萄糖傳感器具有良好的生物相容性，有利于酶活性的保留，且在負(fù)載酶的過程中易于分離，降低了酶活性的損失[11-14]．一般來說，酶在載體上固定的方法主要有共價(jià)鍵合法、包埋法、吸附法和交聯(lián)法[15-18]．其中，吸附法條件溫和，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)影響較小，能夠較好地保持酶的催化活性．本研究采用共沉淀法合成出帶有正電的磁性納米復(fù)合粒子四氧化三鐵-聚乙烯亞胺(Fe3O4-polyethyleneimine，F(xiàn)e3O4-PEI)，并通過靜電吸附作用將帶有負(fù)電的葡萄糖氧化酶修飾到Fe3O4-PEI納米粒子上，以鉑(platinum，Pt)電極為基底電極，制備了電流型葡萄糖傳感器. 電化學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，通過該方法制備的葡萄糖傳感器對(duì)葡萄糖具有優(yōu)異的電化學(xué)催化氧化性能，且靈敏度高、響應(yīng)范圍大、穩(wěn)定性好．

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：日本日立公司SU-70掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)；日本JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)；美國(guó) Quantum Design 公司VersaLab振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)；德國(guó)耐馳公司STA409PC同步熱分析儀；英國(guó)Solartron SI 1260綜合電化學(xué)分析儀．

試劑：FeCl2·4H2O(分析純)、FeCl3·6H2O (分析純)和 聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI，相對(duì)分子質(zhì)量10 000)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司，D-葡萄糖、戊二醛(體積分?jǐn)?shù)為50%)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOx，來源于黑曲霉Aspergillusniger， 25 ℃條件下酶活性大于1 000 U/g)購(gòu)自生物生工(上海)工程有限公司；NaOH、HCl和KH2PO4購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用前未作處理．實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率值為18.2 MΩ·cm)．

1.2 修飾電極的制備

1.2.1 Fe3O4-PEI納米粒子的制備

采用共沉淀法合成Fe3O4-PEI納米粒子[14]，具體過程如下：將0.1 moL的FeCl2·4H2O與0.2 moL的FeCl3·6H2O溶于20 mL 超純水中，在25 ℃高速機(jī)械攪拌條件下將鐵鹽混合溶液勻速滴加到含有125 mL濃度為1.5 mol/L NaOH溶液的三口燒瓶中．滴加完成后，將溫度升高至80 ℃熟化30 min，然后冷卻至室溫，磁分離后用超純水洗5遍，最后分散于110 mL超純水中．反應(yīng)均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行．

在80 ℃高速攪拌條件下將110 mL質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的PEI溶液勻速滴加到Fe3O4溶液中，攪拌30 min．待溶液冷卻，將PEI包覆后的粒子磁分離，用超純水洗5遍，分散于110 mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中保存．

1.2.2 Fe3O4-PEI-GOx/Pt修飾電極的制備

將Pt電極依次用1.00、 0.50和0.05 μm的Al2O3粉在麂皮上打磨拋光，分別在無(wú)水乙醇和超純水中反復(fù)超聲5次，然后，在0.5 mol/L的H2SO4中于-0.2～1.5 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到得到穩(wěn)定循環(huán)伏安曲線，再用超純水超聲清洗，經(jīng)高純氮?dú)獯蹈珊笫褂茫?/p>

將0.5 mL的Fe3O4-PEI復(fù)合納米粒子分散液與1 mL 8 mg/mL GOx溶液(pH=7.4)混合3 h后，移取3 μL混合溶液滴加到處理過的鉑電極表面; 室溫下干燥后，滴加2.5 μL體積分?jǐn)?shù)為1%的戊二醛; 室溫下再次干燥后，在pH=7.4的PBS溶液浸泡30 min．制好的電極不用時(shí)在4 ℃條件下，貯存于pH=7.4的PBS緩沖溶液中．

電化學(xué)測(cè)試采用三電極系統(tǒng)：Fe3O4-PEI-GOx/Pt電極作為工作電極， Ag/AgCl(飽和KCl)作為參比電極，鉑柱電極作為對(duì)電極．

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4-PEI磁性納米復(fù)合粒子的表征

圖1是Fe3O4-PEI納米粒子的SEM和TEM結(jié)果．從圖1可見，采用共沉淀法制備的Fe3O4-PEI納米粒子近似球形．圖1(b)顯示，F(xiàn)e3O4-PEI納米粒子的平均粒徑約為25 nm．

圖1 Fe3O4-PEI納米粒子的SEM圖和 TEM圖Fig.1 SEM and TEM images of Fe3O4-PEI nanoparticles

圖2(a)是通過振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(vibrating sample magnetometer, VSM)測(cè)定的磁滯回線，F(xiàn)e3O4納米粒子的粒徑小于臨界尺寸，矯頑力和剩磁幾乎都為0，表現(xiàn)出超順磁性．Fe3O4納米粒子的飽和磁化值M為52.1emu/g，有較高的磁響應(yīng)性；Fe3O4-PEI納米粒子的M為38.2emu/g．飽和磁化值的下降可能是包裹在磁性納米粒子表面的PEI所引起的．從圖2(b)中的熱重(thermogravimetry,TG)曲線分析得知，F(xiàn)e3O4-PEI粒子的失重分為兩個(gè)階段，第1階段在120 ℃以下，失重率為3.1%，這個(gè)溫度段的失重是真空干燥后復(fù)合納米粒子中仍殘留的結(jié)合水蒸發(fā)所致；第2階段是從120 ℃開始并最終趨于穩(wěn)定， 這段的失重主要是聚合物PEI分解造成的．經(jīng)計(jì)算，PEI在Fe3O4表面的包覆量為約23.26%．

圖2 VSM和TG表征結(jié)果Fig.2 Results of VSM curves and TG curves

2.2Fe3O4-PEI-GOx/Pt對(duì)葡萄糖的電催化氧化

圖3是PEI-Fe3O4-GOx/Pt修飾電極對(duì)不同濃度的葡萄糖響應(yīng)的循環(huán)伏安法(cyclicvoltammetry，CV)曲線圖．從圖3可見，加入1mmol/L葡萄糖后，修飾電極的氧化電流明顯增大.隨著葡萄糖濃度持續(xù)增加，修飾電極的氧化電流也不斷增大． 這些結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4-PEI-GOx/Pt修飾電極對(duì)葡萄糖濃度具有較好的線性響應(yīng)．

圖3 修飾電極在葡萄糖濃度分別為0、1、2、3和 4 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(0.05 mmol/L, pH=7.4)中的循環(huán)伏安圖(掃描速度50 mV/s)Fig.3 CV curves of Fe3O4-PEI-GOx/Pt with 0, 1, 2, 3, and 4 mmol/L glucose in PBS buffer solution (pH=7.4, scan rates: 50 mV/s)

2.3 工作條件的優(yōu)化

工作電壓及緩沖液pH值的優(yōu)化對(duì)葡萄糖傳感器的性能有著重要影響．通常，較高的工作電位有利于增加葡萄糖傳感器的電流響應(yīng)值，但對(duì)血液中存在的抗壞血酸和尿酸等電活性物質(zhì)的抗干擾能力會(huì)有所降低．相反，較低的電位有助于獲得較好的抗干擾能力，但低電位下的電流響應(yīng)會(huì)相應(yīng)的降低。此外，葡萄糖氧化酶作為一種生物催化劑，其活性易受pH值影響，較高或較低的pH值都會(huì)造成其活性的降低或損失．圖4是Fe3O4-PEI-GOx/Pt修飾電極工作電位及pH值(優(yōu)化結(jié)果)．從圖4可見，在工作電位超過0.4V，pH值在7.0～8.5時(shí)，修飾電極具備較高的電流響應(yīng)．考慮到修飾電極的干擾性及正常人體血液的pH值(7.4左右)，最優(yōu)測(cè)試參數(shù)可選擇為：工作電位0.4V；PBS緩沖液pH=7.4．

圖5 連續(xù)加入葡萄糖時(shí)Fe3O4-PEI-GOx/Pt 在0.4 V、 pH=7.4 條件下的電流響應(yīng)圖 (小圖是其電流與其對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度線性曲線圖)Fig.5 Amperometric responses of Fe3O4-PEI-GOx/Pt for successive addition of glucose solution at optimal conditions (0.4 V, pH=7.4) (Inset: linear relationship of response current versus the concentration of glucose)

2.4 傳感器的性能

在最佳測(cè)試參數(shù)條件下(工作電壓為0.4V，在pH=7.4，0.05mol/LPBS溶液中測(cè)試)，利用計(jì)時(shí)安培法，研究了PEI-Fe3O4-GOx/Pt電極對(duì)葡萄糖的催化性能，如圖5所示．從圖5可見， 隨著葡萄糖的不斷加入，相應(yīng)的響應(yīng)電流呈階躍式增加．在0.39～6.36mmol/L之間，電流響應(yīng)值與葡萄糖濃度c呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為i=2.999c+1.324，R=0.992．電極的檢出限為1×10-8mol/L，靈敏度為95.5μA/(mmol·L-1·cm2)．

2.5 抗干擾性及耐久性

由于在傳感器的實(shí)際操作中，人體血液中的尿酸(uricacid，UA)、抗壞血酸(ascorbicacid，AA)會(huì)對(duì)葡萄糖濃度的測(cè)定產(chǎn)生干擾，因此，通過計(jì)時(shí)安培法研究這些物質(zhì)在Fe3O4-PEI-GOx/Pt電極上的響應(yīng). 工作電壓為0.4V條件下，在pH=7.4的PBS中分別加入葡萄糖、尿酸和抗壞血酸溶液．如圖6(a)所示，當(dāng)加入葡萄糖溶液后，響應(yīng)電流迅速增加并在極短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，而加入抗壞血酸和尿酸后響應(yīng)電流值基本沒有變化．這說明制備的電極具有較好的選擇性, 可消除其他物質(zhì)的干擾．

圖6 傳感器的選擇性和穩(wěn)定性Fig.6 The selectivity and stability of the biosensor

GOx的等電點(diǎn)在4.6左右. 在pH=7.4的PBS中，GOx由于羧基電離而帶負(fù)電；通常，包覆在納米粒子表面的高分子可以顯著影響納米粒子的空間行為. 包覆在Fe3O4納米粒子上的PEI在Fe3O4-PEI-GOx復(fù)合納米粒子形成過程中具有重要作用，它有效地阻止了Fe3O4納米粒子的聚沉；其次，由于包覆在Fe3O4納米粒子表面的PEI氨基電離使Fe3O4-PEI表面帶有正電荷[19-21]，可以通過靜電作用將GOx固定在其表面． 將制備的電極在4 ℃條件下浸入PBS溶液中存儲(chǔ)30d后，仍能保持90%的響應(yīng)電流, 如圖6(b)所示． 這種較長(zhǎng)時(shí)間的耐久性一方面歸功于Fe3O4-PEI納米粒子具有較好生物相容性，另一方面，與酶在載體上比較溫和的固定，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)破壞較少有關(guān)．

結(jié) 語(yǔ)

通過共沉淀法制備了粒徑較為均一的核殼型Fe3O4-PEI復(fù)合納米粒子，并將其應(yīng)用在電流型酶葡萄糖傳感器上．在0.4V的工作電壓下，制備的Fe3O4-PEI-GOx/Pt電極對(duì)葡萄糖具有良好的催化活性，靈敏度高達(dá)95.5μA/(mmol·L-1·cm2)，電流響應(yīng)與葡萄糖濃度在0.39～6.36mmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗干擾性能．由于制備的Fe3O4-PEI納米粒子具備良好的生物相容性且能夠較長(zhǎng)時(shí)間的保持吸附在其表面的葡萄糖氧化酶的活性，對(duì)實(shí)現(xiàn)該類型葡萄糖傳感器產(chǎn)業(yè)化具有重要意義．

/ References：

[1] Heller A, Feldman B. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management[J]. Chemical Reviews, 2008, 108(7): 2482-2505.

[2] Mathew M, Sandhyarani N. A highly sensitive electrochemical glucose sensor structuring with Nickel hydroxide and enzyme glucose oxidase[J]. Electrochimica Acta, 2013, 108: 274-280.

[3] Wu Shouguo, Liu Gang, Li Ping, et al. A high-sensitive and fast-fabric glucose biosensor based on Prussian blue/topological insulator Bi2Se3hybrid film[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 38(1): 289-294.

[4] Huang Kejing, Wang Lan, Li Jing, et al. Glassy Carbon electrode modified with glucose oxidase-graphene-nano-copper composite film for glucose sensing[J]. Measurement, 2013, 46(1): 378-383.

[5] Lin Jiehua, He Chunyan, Zhao Yue, et al. One-step synthesis of Silver nanoparticles/Carbon nanotubes/chitosan film and its application in glucose biosensor[J]. Sensors and Actuators B-Chemical, 2009, 137(2): 768-773.

[6] Wang Zhijuan, Zhou Xiaozhu, Zhang Juan, et al. Direct electrochemical reduction of single-layer graphene oxide and subsequent functionalization with glucose oxidase[J]. Journal of Physical Chemistry C, 2009, 113(32): 14071-14075.

[7] Toghill K E,Compton R G.Electrochemical non-enzymatic glucose sensors: a perspective and an evaluation[J].International Journal of Electrochemical Science, 2010, 5(9): 1246-1301.

[8] Xia Tingting, Guan Yueping, Yang Mingzhu, et al. Synthesis of polyethylenimine modified Fe3O4nanoparticles with immobilized Cu2+for highly-efficient proteins adsorption[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2014, 443: 552-559.

[9] Hultman K L, Raffo A J, Grzenda A L, et al. Magnetic resonance imaging of major histocompatibility class II expression in the renal medulla using immunotargeted superparamagnetic Iron oxide nanoparticles[J]. ACS Nano, 2008, 2(3): 477-484.

[10] Wang Aijun, Li Yongfang, Li Zhonghua, et al. Amperometric glucose sensor based on enhanced catalytic reduction of Oxygen using glucose oxidase adsorbed onto core-shell Fe3O4@silica@Au magnetic nanoparticles[J]. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications, 2012, 32(6): 1640-1647.

[11] Marand Z R, Shahtahmassebi N, Housaindokht M R, et al. Construction of an amperometric glucose biosensor by immobilization of glucose oxidase on nanocomposite at the surface of FTO electrode[J]. Electroanalysis, 2014, 26(4): 840-848.

[12] Sharma R, Sinha R K, Agrawal V V. Electroactive prussian blue encapsulated iron oxide nanostructures for mediator-free cholesterol estimation[J]. Electroanalysis, 2014, 26(7): 1551-1559.

[13] Tan Xuecai, Zhang Jinlei, Tan Shengwei, et al. Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on horseradish peroxidase immobilized on Fe3O4/chitosan modifiedGlassy carbon electrode[J]. Electroanalysis, 2009, 21(13): 1514-1520.

[14] Teymourian H, Salimi A, Firoozi S. A high performance electrochemical biosensing platform for glucose detection and IgE aptasensing based on Fe3O4/reduced graphene oxide nanocomposite[J]. Electroanalysis, 2014, 26(1): 129-138.

[15] Pellissier M, Zigah D, Barriere F, et al. Optimized preparation and scanning electrochemical microscopy analysis in feedback mode of glucose oxidase layers grafted onto conducting carbon surfaces[J]. Langmuir, 2008, 24(16): 9089-9095.

[16] Jeykumari D R S,Narayanan S S.A novel nanobiocomposite based glucose biosensorusing neutral red functionalized carbon nanotubes[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23(19) : 1404-1411.

[17] Gooding J J, Praig V G, Hall E A H. Platinum-catalyzed enzyme electrodes immobilized on gold using self-assembled layers[J]. Analytical Chemistry, 1998, 70(11): 2396-2402.

[18] Yu Jiuhong, Liu Songqin, Ju Huangxian. Glucose sensor for flow injection analysis of serum glucose based on immobilization of glucose oxidase in titania sol-gel membrane[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2003, 19(4): 401-409.

[19] Lou Lei, Yu Ke, Zhang Zhengli, et al. Dual-mode protein detection based on Fe3O4-Au hybrid nanoparticles[J]. Nano Research, 2012, 5(4): 272-282.

[20] Zhou Xi, Xu Wenlong, Wang Yan, et al. Fabrication of cluster/shell Fe3O4/Au nanoparticles and application in protein detection via a SERS method[J]. Journal of Physical Chemistry C, 2010, 114(46): 19607-19613.

[21] Goon I Y, Lai L M, Lim M, et al. Fabrication and dispersion of Gold-Shell-Protected magnetite nanoparticles: systematic control using polyethyleneimine[J]. Chemistry of Materials, 2009, 21(4): 673-681.

【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：新 谷】

Glucose sensor based on Fe3O4-PEI nanoparticles

He Chuanxin?, Ren Shengying, Xie Minsui, Yuan Anpeng, Hong Fei,Zhang Qianling, and Liu Jianhong?

College of Chemistry and Chemical Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China

Fe3O4-PEI nanoparticles with Fe3O4core and polyethylenimine (PEI) shell were prepared via the co-precipitation method. Results from scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM) show that Fe3O4-PEI nanoparticles present globular shape with almost uniform diameters of about 25 nm. Magnetic hysteresis loops of Fe3O4-PEI and Fe3O4nanoparticles were obtained by a vibrating sample magnetometer (VSM). The magnetism of Fe3O4nanoparticles still remains a lot after coating with PEI, and the saturation magnetization value of Fe3O4-PEI nanoparticles is 38.2 emu/g. Thermogravimetry (TG) analysis indicats that the loading amount of PEI on the surface of Fe3O4nanoparticles is about 23.26%. The glucose oxidase (GOx) enzyme was immobilized on the Fe3O4-PEI nanoparticles surface by electrostatic interaction. Fe3O4-PEI-GOx/Pt glucose sensor was prepared with platinum (Pt) as its basal electrode, which exhibits a good electrochemical catalysis for glucose, high sensitivity, strong anti-interference ability and long-term durability for glucose detection under an optimal preparation condition.

polymer chemistry; glucose sensor; magnetic nanoparticles; polyethyleneimine; glucose oxidase; electrostatic interaction

：He Chuanxin, Ren Shengying, Xie Minsui, et al. Glucose sensor based on Fe3O4-PEI nanoparticles[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2015, 32(1): 76-81.(in Chinese)

O 63

A

10.3724/SP.J.1249.2015.01076

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21374064，21004040)

何傳新(1983—)，男(漢族)，安徽省宣城市人，深圳大學(xué)副教授、博士．E-mail：hechuanxin2002@163.com

Received：2014-08-14；Accepted：2014-10-19

Foundation：National Natural Science Foundation of China (21374064, 21004040)

? Corresponding author：Associate professor He Chuanxin. E-mail:hechuanxin2002@163.com; Professor Liu Jianhong. E-mail: Liujh@szu.edu.cn

引 文：何傳新，任圣穎，謝敏隨，等. 基于Fe3O4-PEI納米粒子構(gòu)建葡萄糖傳感器的研究[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2015，32(1)：76-81.