蔡雪雁 李厚華 李玲 于航 陳蓋 包努恩都特

(西北農(nóng)林科技大學，楊凌，712100)

責任編輯:任 俐。

隨著社會發(fā)展，人們對色彩美的需求越來越強烈，不僅僅局限于欣賞自然界天然的綠色之美，而更加追求紅肥綠瘦的變化之美、炫彩斑斕的多樣之美。但色彩繽紛的花朵花期短，遠不能滿足人們對自然之物的長久欣賞、留戀之意，而植物葉片具有發(fā)育周期長，觀賞期長的優(yōu)勢，彩葉樹種就成了人們追捧的新奇之物［1］。在越來越多的園林景觀設計中，彩葉樹種不僅用來點綴、裝飾、豐富色彩，更是被用來與其他景觀要素相協(xié)調(diào)，充分營造植物空間的層次感及豐富植物景觀，表達特定的園林意境［2］。

雞爪槭(Acer palmatum Thunb)為槭樹科槭樹屬彩葉樹種，落葉小喬木。葉色初春鮮紅、夏季變綠，到了秋天再變紅，季相變化豐富，且其色彩變化契合季節(jié)變換，夏為綠色，給人一種清涼感，秋則轉(zhuǎn)紅，平添秋意，加之樹姿瀟灑而體量適中，可種植形式多樣，在園林景觀中應當更加廣泛的應用。目前，對雞爪槭轉(zhuǎn)色期葉片色素的研究，主要集中在葉綠素、總花青苷、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)、生理變化和影響顏色變化的因子方面［3－6］，還未對決定其葉色變化色素進行細化研究。本研究旨在對雞爪槭各變色時期的主要成色色素進行分析，闡述其變色機理，為彩葉植物新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

以2013年采自本地校園內(nèi)的雞爪槭葉片為試驗材料，選取生長健壯、長勢一致的植株，從初春開始，依次采集雞爪槭7個變色時期(即雞爪槭由鮮紅變黃綠，黃綠變深綠再變紫紅的過程)向陽生長的無破損的葉片(中位葉)，包括芽葉期、展葉期、初葉期、小綠期、大綠期、綠葉期和紅葉期。取樣重復3次，保存于－80℃。

標準品有矢車菊素、槲皮素、矢車菊素半乳糖苷、矮牽牛素、綠原酸、蘆丁、二氫楊梅酮、香豆酸、對香豆酸、楊梅素、兒茶素、表兒茶素、根皮苷。

將冰箱中－80℃凍存的材料轉(zhuǎn)置于真空冷凍干燥機，處理48 h后，研磨成粉末備用。

類黃酮提取液:分別精確稱量7個變色時期葉片粉末0．25 g，加10 mL甲醇提取，超聲3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用原溶液定容至10 mL［7］，重復3次。

葉綠體色素提取液:分別精確稱量7個變色時期葉片粉末0．1 g，加10 mL 96%乙醇提?。?］，重復3次。

花青苷提取液:分別精確稱量7個變色時期葉片粉末0．25 g，加10 mL 1%甲醇鹽酸提取液提取，超聲3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用原溶液定容至10 mL［7］，重復3次。

花青素萃取液:取300μL花青苷提取液及600 μL 2N鹽酸加入小離心管中，95℃金屬浴加熱45 min。冰上冷卻后加入300μL 3－甲基丁醇，劇烈晃動，離心10 min(8 000 r·min－1，4℃)。置于4℃冰箱待其分層，上層液體含有花青苷水解后的花青素和其他類黃酮，收集上相［7］。

光譜鑒定:用島津－2450紫外可見分光光度計對上述類黃酮、花青苷提取液及花青素萃取液在200～600 nm檢測吸收波峰，對雞爪槭葉片中所含色素種類進行初步鑒定［9］。

光度測定:用分光光度計分別在663、645、470 nm下測定葉綠體色素提取液在各個吸收波長處的吸收值，據(jù)此計算葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)［8］，計算公式如下:

色素質(zhì)量分數(shù)=(色素質(zhì)量濃度×提取液總量×稀釋倍數(shù)/樣品量)×1 000。

式中:C代表質(zhì)量分數(shù);D代表吸光度;a代表葉綠素a;b代表葉綠素b;x代表類胡蘿卜素;t代表葉綠素(a+b)。

薄層層析分析:取類黃酮提取液、花青素萃取液按順序點樣于薄層板上，將薄層板放置于流動相Formic(V(濃鹽酸)∶V(甲酸)∶V(水)=2∶5∶3)中展開，根據(jù)Rf值(Rf=原點至組分斑點中心的距離/原點至溶劑前沿的距離)來輔助判斷花青素/苷種類［7］。對于自然狀態(tài)觀察不到的類黃酮物質(zhì)，在紫外光(254 nm)下和氨水熏蒸薄層板后觀察顏色變化來推斷［10－11］。

高效液相色譜分析:用高效液相色譜儀檢測(L－2000)，二極管陣列檢測器(L－2455)，檢測波長200～700 nm。檢測參數(shù)為C18柱，進樣量為10μL，柱溫40℃，流速0．50 mL·min－1。檢測波長為280、360、520、535 nm。流動相參數(shù)為A是0．04%的甲酸水溶液，B是色譜級乙腈。梯度洗脫，0～40 min，A．95%～0，B．5%～100%;40～60 min，B．100%。由標準品檢測結(jié)果繪制標曲，計算葉片中各單體酚的質(zhì)量分數(shù)(mg·kg－1)［7］。

pH值測定:pH值采用細胞液提取法(cell sap extract)測定，采后鮮葉研磨，用pH酸度計進行檢測［12］。

統(tǒng)計分析:采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)、SPSS軟件做相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 紫外可見分光光度計檢測

2．1．1 初步鑒定色素類別

雞爪槭各變色時期葉片類黃酮提取液、花青苷提取液和花青素萃取液光譜掃描結(jié)果顯示，類黃酮提取液:芽葉期葉片類分別在紫外區(qū)280、290、330 nm有吸收峰，推測其可能含有黃酮醇類、二氫黃酮醇類及酚酸類物質(zhì);展葉期、小綠期和大綠期葉片檢測到分別在210、250、330、380 nm有吸收峰，推測其可能含有黃酮醇類、黃烷酮類及酚酸類物質(zhì);初葉期、綠葉期和紅葉期葉片分別在210、240、255、330、390 nm有吸收峰，推測其可能含有黃酮醇類、黃烷酮類及酚酸類物質(zhì)［13］?；ㄇ嘬仗崛∫?芽葉期分別在紫外區(qū)210、275、330 nm和可見光區(qū)530 nm處檢測到花青苷特征吸收峰，推測芽葉期葉片中可能存在花青苷類物質(zhì)，且種類很可能是矢車菊素［14］;展葉期、初葉期、小綠期、大綠期、綠葉期、紅葉期雞爪槭葉片分別在210、275、330、470、530 nm檢測到吸收峰，推測其可能含有花青苷類物質(zhì)及類胡蘿卜素［13］?；ㄇ嗨剌腿∫?各時期除了檢測到花青苷特征吸收峰外，還檢測到初葉期和紅葉期水解萃取液在329 nm下有吸收峰，該波峰位于300～330 nm，表明該花青苷分子內(nèi)有?；浣Y(jié)合的糖基可能為半乳糖［15］。

2．1．2 葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)變化

光度測定的結(jié)果表明，雞爪槭葉片中葉綠素的質(zhì)量分數(shù)和類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)變化趨勢基本一致。前3個時期質(zhì)量分數(shù)變化趨勢平穩(wěn)，波動極小;從初葉期開始，葉綠素的質(zhì)量分數(shù)開始逐漸增加，到了大綠期增加的幅度變大，類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)從大綠期開始增加，這使得綠葉期葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)均達到最大值，質(zhì)量分數(shù)分別是最小值的2．56倍和1．84倍;綠葉期到紅葉期二者質(zhì)量分數(shù)開始急速下降，且最終質(zhì)量分數(shù)均略低于芽葉期(表1)。

表1 不同葉片發(fā)育時期葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)變化

2．2 薄層層析色譜分析

將雞爪槭葉片花青素萃取液及花青苷提取液按變色時期，順序點樣進行薄層層析，結(jié)果表明，各變色時期葉片提取液均觀察到紅色斑點，花青苷提取液觀察到兩個肉眼可見的紅色斑點，花青素萃取液觀察到一個肉眼可見的紅色斑點。葉片芽葉期、展葉期、初葉期和紅葉期在薄層層析板上紅色斑點顏色較深，小綠期、大綠期和綠葉期斑點顏色很淡。芽葉期到綠葉期斑點逐漸變淺，說明花青苷/素的質(zhì)量分數(shù)逐漸減少;紅葉期斑點加深，說明花青苷/素質(zhì)量分數(shù)增加。計算結(jié)果表明，兩個斑點的Rf值分別為0．22和0．57，與標準品Rf值進行對比，與矢車菊素及矢車菊素半乳糖苷的基本一致，因此，可以初步推測雞爪槭葉片花青苷類物質(zhì)的種類可能為矢車菊素及矢車菊素半乳糖苷［15］。

薄層板在紫外燈照射下，條帶中出現(xiàn)了Rf值為0．07，呈現(xiàn)亮黃色的斑點，而在可見光下此斑點呈現(xiàn)無色，推測可能為二氫黃酮醇類物質(zhì);同時還觀測到了Rf值為0．66，呈現(xiàn)淡藍色的新斑點，推測可能為黃烷酮類物質(zhì);而可見光下顯示為淺紅色的斑點在紫外光下為暗橙色，進一步驗證了該物質(zhì)為花青苷類物質(zhì)［7］。

將薄層板用氨氣熏蒸后，在可見光下顯現(xiàn)淺紅色的斑點變?yōu)樗{色?；ㄇ嘬疹愇镔|(zhì)酸性條件下呈亮紅色，堿性條件下呈藍色。因此，結(jié)合自然光下和紫外燈照射下薄層層析的結(jié)果，可以判斷萃取液中含有花青苷類物質(zhì)矢車菊素和矢車菊素半乳糖苷［16］。

2．3 高效液相色譜法檢測

2．3．1 葉片中的色素組成

高效液相色譜對雞爪槭各時期葉片花青苷提取液檢測結(jié)果顯示，520 nm下檢測到在保留時間18．56 min處有吸收峰出現(xiàn)，對照標準品，鑒定為矢車菊半乳糖苷，同時還檢測到微弱的矢車菊素、矮牽牛素、槲皮素的吸收峰(表2)。對比紫外及薄層層析結(jié)果，可以確定矢車菊素半乳糖苷是雞爪槭葉片中的主要花色苷。

雞爪槭各時期葉片花青素萃取液檢測結(jié)果顯示，在520 nm下，矢車菊素半乳糖苷的信號強度減弱，而矢車菊素的信號強度增強，原因是矢車菊素衍生糖苷只含有矢車菊素半乳糖苷一種，矢車菊素半乳糖苷水解為矢車菊素而質(zhì)量分數(shù)下降，表現(xiàn)為信號強度下降。

雞爪槭各時期葉片花青苷提取液在280 nm下的檢測結(jié)果顯示，檢測到的吸收峰與表1中編號4到13的這10種標準品出峰時間一致，結(jié)合薄層和紫外檢測結(jié)果，可以判斷出以下單體酚的存在(表2)。

表2 標準品保留時間及標準曲線

2．3．2 葉片中的色素變化

雞爪槭葉片各變色時期單體酚質(zhì)量分數(shù)計算結(jié)果如表3，將13種單體酚質(zhì)量分數(shù)與葉片發(fā)育時期做顯著性分析，可知矢車菊素、矢車菊素半乳糖苷、綠原酸、對香豆酸、楊梅素與葉片發(fā)育時期有顯著相關性，其余單體酚則是有極顯著相關性。矢車菊素半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢為從芽葉期到綠葉期，矢車菊素半乳糖苷的質(zhì)量分數(shù)快速降低，從3 509．51 mg·kg－1降低到46．88 mg·kg－1;從綠葉期開始，質(zhì)量分數(shù)大幅升高，直到紅葉期質(zhì)量分數(shù)達到最大值3 541．11 mg·kg－1。矢車菊素質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢與矢車菊素半乳糖苷一致;同屬花青素的矮牽牛素，質(zhì)量分數(shù)在整個葉片發(fā)育時期變化幅度不大;其他檢測到的單體酚中，兒茶素的質(zhì)量分數(shù)從芽葉期到展葉期增加，展葉期到大綠期降低，隨后增加，紅葉期質(zhì)量分數(shù)最高;綠原酸質(zhì)量分數(shù)從芽葉期到展葉期增加，展葉期到初葉期降低，初葉期到小綠期增加，小綠期到綠葉期降低，綠葉期到紅葉期大幅增加，紅葉期質(zhì)量分數(shù)最高;表兒茶素、香豆酸和楊梅素的質(zhì)量分數(shù)都在展葉期增加到了最大值，隨后質(zhì)量分數(shù)降低，從綠葉期到紅葉期質(zhì)量分數(shù)又有所增加;二氫楊梅酮的質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先降低后增加如此往復的變化趨勢，紅葉期質(zhì)量分數(shù)最高;蘆丁質(zhì)量分數(shù)從芽葉期到小綠期增加，小綠期到綠葉期降低，到了紅葉期再增加到最高;對香豆酸的質(zhì)量分數(shù)從芽葉期到展葉期增加，展葉期到大綠期降低，大綠期到綠葉期增加，綠葉期到紅葉期降低;根皮苷的質(zhì)量分數(shù)，從芽葉期到展葉期增加，從展葉期到大綠期降低，大綠期到紅葉期增加;槲皮素的質(zhì)量分數(shù)從芽葉期到展葉期降低，從展葉期到初葉期增加，初葉期到綠葉期降低，綠葉期到紅葉期增加，紅葉期質(zhì)量分數(shù)最高。

表3 不同葉片發(fā)育時期單體酚質(zhì)量分數(shù)的變化 mg·kg－1

總花青苷質(zhì)量分數(shù)和葉綠素質(zhì)量分數(shù)的比值變化趨勢，從芽葉期到綠葉期，比值依次為1．89、0．77、0．31、0．28、0．15和0．13，可以看出比值下降，且僅在芽葉期這個比值大于1;綠葉期到紅葉期，二者比值驟然上升到3．32，且達到了最大值。

2．4 pH值測定

pH值檢測結(jié)果表明，雞爪槭葉片發(fā)育的各個時期細胞液的pH值分別為5．30、5．40、5．20、5．20、5．50、5．40和5．40，當pH值為5．20～5．50時，pH值與各時期葉綠素和總花青苷質(zhì)量分數(shù)的相關系數(shù)分別為0．34和0．04，且相關性不顯著。

3 結(jié)論與討論

高效液相色譜檢測結(jié)果顯示，可以導致雞爪槭葉片呈現(xiàn)紅色的花青素/苷有矢車菊素、矢車菊素半乳糖苷及矮牽牛素，但是在薄層層析檢測中，花青素萃取液中沒有觀測到矮牽牛素和矢車菊素半乳糖苷的斑點，高效液相色譜分析，矮牽牛素在各變色時期中最高質(zhì)量分數(shù)僅為365．80 mg·kg－1，而矢車菊素半乳糖苷的最高質(zhì)量分數(shù)是矮牽牛素最高質(zhì)量分數(shù)的9．68倍，據(jù)此推斷矮牽牛素未觀察到斑點的原因可能是質(zhì)量分數(shù)過低，也可能是顯色情況肉眼無法觀測［14］。在花青素萃取液中，觀察到矢車菊素卻沒有觀察到矢車菊素半乳糖苷的顯色斑點，原因很可能是大量矢車菊素半乳糖苷水解為矢車菊素，使得矢車菊素質(zhì)量分數(shù)明顯增加而顯示斑點;花青苷提取液中觀察到了矢車菊素和矢車菊素半乳糖苷的兩個斑點，這可能是因為矢車菊素半乳糖苷的不完全水解，增加了矢車菊素的質(zhì)量分數(shù)，使得兩者同時存在。

紫外分光光度計光度檢測和高效液相色譜單體酚質(zhì)量分數(shù)計算結(jié)果顯示，單體酚質(zhì)量分數(shù)和雞爪槭葉片發(fā)育時期顯著相關，從芽葉期到初葉期葉綠素質(zhì)量分數(shù)變化幅度極小，幾乎呈水平趨勢，而矢車菊素半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)急劇下降，從3 509．51 mg·kg－1降到379．49 mg·kg－1，此時，雞爪槭葉色從鮮紅色轉(zhuǎn)變成淺紅色，紅色逐漸變淺，矢車菊素半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)急劇下降是葉色變化的主要原因;初葉期到綠葉期，葉綠素的質(zhì)量分數(shù)從1 283．56 mg·kg－1逐步增加，在綠葉期達到最高值3 215．91 mg·kg－1，而矢車菊素半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)從379．49 mg·kg－1下降到最低值46．88 mg·kg－1，雞爪槭葉片從淺紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，此段時間葉色轉(zhuǎn)變是葉綠素大量積累和花青苷質(zhì)量分數(shù)降低共同作用的結(jié)果;綠葉期是雞爪槭變色期中持續(xù)時間最長的時間段，從6月下旬到9月下旬，大約3個月，綠葉期到紅葉期，葉綠素質(zhì)量分數(shù)由最高值3 215．91 mg·kg－1下跌到最低值1 257．39 mg·kg－1，矢車菊素半乳糖苷的質(zhì)量分數(shù)則是從最低值46．88 mg·kg－1上升到最高值3 541．11 mg·kg－1，葉色由深綠轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t，這個時期葉色急劇變化是葉綠素和矢車菊素半乳糖苷相互作用的結(jié)果。從總花青苷和葉綠素的質(zhì)量分數(shù)比變化趨勢看，在兩者比值大于1的芽葉期和紅葉期，綠色互補效應弱，葉片呈現(xiàn)紅色;而在其他時期，比值都小于1，綠色互補效應強，葉片呈現(xiàn)出不同程度的綠色，從展葉期到綠葉期比值越來越小，雞爪槭葉片的顏色越來越綠，由此可見，二者的比值是決定葉色的關鍵因素。

植物葉片的顏色是自身的遺傳因子和外界環(huán)境共同作用的結(jié)果，葉色表達不僅與色素的種類、質(zhì)量分數(shù)和分布有關，葉片內(nèi)部的pH值同是影響葉色的重要因素之一?；ㄉ盏姆€(wěn)定性受到pH值很大影響，隨著pH值的升高，穩(wěn)定性降低［17］。而本試驗中，雞爪槭不同葉片發(fā)育時期pH值基本穩(wěn)定，與總花青苷質(zhì)量分數(shù)間相關性弱，說明其葉色變化與pH值無關，是色素分配的結(jié)果。在酸性pH值下，矢車菊素半乳糖苷的顏色應為亮紅色［18］，而葉片顏色在其質(zhì)量分數(shù)最高的紅葉期呈紫紅色，導致這種現(xiàn)象的原因可能是大量葉綠素的存在，矢車菊素半乳糖苷的亮紅色與葉綠素的綠色為互補色，二者質(zhì)量分數(shù)相互作用，且矢車菊素及其衍生糖苷占主導地位，導致雞爪槭葉片呈現(xiàn)紫紅色。

除了葉綠素、矢車菊素、矢車菊素半乳糖苷和矮牽牛素以外，葉色呈現(xiàn)紅色，其他色素起到了輔助作用，包括類胡蘿卜素類、黃酮醇類(蘆丁、楊梅素、槲皮素)、黃烷酮類(兒茶素、表兒茶素)、酚酸類(綠原酸、香豆酸、對香豆酸)、二氫黃酮醇類(二氫楊梅素)、根皮苷［19－20］。

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