楊邵 束慶龍 姚小華 龍偉 王開良 任華東 滕建華

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥，230036) (中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所) (浙江省金華市婺城區(qū)東方紅林場)

責(zé)任編輯:程 紅。

油茶(Camellia oleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木，是我國南方重要的經(jīng)濟(jì)林木［1］。當(dāng)前，芽苗砧嫁接是油茶良種繁育的主要途徑，而嫁接親和性是影響嫁接成活率的關(guān)鍵因素。油茶嫁接親和性受到遺傳、解剖結(jié)構(gòu)、生長特性、生理生化、環(huán)境條件等多種因素的影響，是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，因此，嫁接親和性的機(jī)理研究一直未能得到明晰的回答，是嫁接領(lǐng)域研究的難點(diǎn)［2］。陳紅等［3］研究探索了茄子/番茄嫁接體嫁接愈合過程砧木和接穗的生理生化相互作用對(duì)嫁接親和性的影響，也有研究對(duì)黃瓜等［4－7］嫁接體SOD活性、CAT活性、POD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與嫁接親和性進(jìn)行了研究。但至目前為止，有關(guān)油茶嫁接愈合過程中生理生化的變化規(guī)律尚未見報(bào)道。本研究對(duì)油茶不同品種接穗嫁接愈合過程中結(jié)合部的生理指標(biāo)及死亡率的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，以期揭示不同油茶品種嫁接組合的親和性及其機(jī)理，為更好地選擇品種組合、提高芽苗砧嫁接成活率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

供試種子于2013年10月采自浙江省金華市婺城區(qū)東方紅林場，穗條分別來自于同一品種植株上部的半木質(zhì)化的當(dāng)年生枝條。取普通油茶長林系列4#、18#品種穗條為接穗，以普通油茶長林系列18#品種芽苗作為砧木，嫁接后嫁接體組合分別為4/18、18/18。種子沙藏催芽后待生長為健壯的芽苗，從胚芽近基部2 cm處切除胚芽，并將主根頂端切除保留6 cm左右作為砧木。穗條長度為3 cm，保留有一個(gè)葉片和一個(gè)葉芽，栽種于苗床上，苗床上方用農(nóng)膜搭起50 cm高的小拱棚保濕，栽種45 d后揭膜。

1．2 方法

試驗(yàn)設(shè)計(jì):每種嫁接組合各嫁接450株，于5月29日嫁接中取樣1次，嫁接移栽后前6 h，每2 h取樣1次，共3次;第6小時(shí)至第16小時(shí)，每5 h取樣1次，共2次;第16小時(shí)至第24小時(shí)，8 h取樣1次;第3天至第9天，每2 d取樣1次，共4次;第15天至第55天，每10 d取樣1次，共5次;總共16次。采用完全隨機(jī)的方法取樣，每次取樣15株，重復(fù)3次，截取嫁接結(jié)合部1．0～1．5 cm的部分在流水中清洗干凈，裝入自封袋中。

死亡率的測定:每次取樣前先清除接穗枯萎的嫁接體，并計(jì)數(shù)為ni，油茶芽苗砧嫁接體的動(dòng)態(tài)死亡率pi=(ni/(N－∑ni－1－∑Ai－1))×100%。式中:N為總的嫁接體株數(shù);A為每次取樣的嫁接體株數(shù);i為取樣次數(shù)。

理化指標(biāo)測定:稱取樣品鮮質(zhì)量0．2 g于預(yù)冷的研缽中，加入10 mL預(yù)冷的pH=7．8磷酸緩沖液，用液氮研磨提取，然后將提取液于4℃，105 000 r·min－1離心15 min，取上清液為酶液，放入冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩Ｑ趸锲缁?SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法［8］測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用H2O2法［9］測定，過氧化物酶活性(POD)采用愈創(chuàng)木酚法［10］測定，丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度用硫代巴比妥酸法［11］測定，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法［12］測定，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)用考馬斯亮藍(lán)G250顯色法測定［13］。測定可容性蛋白、丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶活性的材料于冰箱中－70℃保存，測定可溶性糖的材料貯藏于－20℃。待取樣完成后進(jìn)行統(tǒng)一測定。

數(shù)據(jù)分析:對(duì)每個(gè)時(shí)間段內(nèi)的指標(biāo)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測定，取平均值代表這個(gè)時(shí)期的指標(biāo)水平。采用Pearson相關(guān)分析法分析對(duì)應(yīng)時(shí)間的嫁接體死亡率和各指標(biāo)間的相關(guān)性，所使用軟件為SPSS 19．0。

2 結(jié)果與分析

2．1 嫁接組合的成活率

在油茶芽苗砧結(jié)合部傷口愈合過程中由于嫁接不親和等因素導(dǎo)致部分植株死亡，其典型特征為:植株葉片缺少光澤，顏色由深綠色變成淺黃色，腋芽枯萎，最后葉片脫落，接穗干枯，結(jié)合部死亡。2個(gè)嫁接組合的死亡率見表1。4/18結(jié)合部在發(fā)育過程中死亡率要低于18/18結(jié)合部(除第5天外)，且都表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢;4/18結(jié)合部死亡率分別在第7天、第15天出現(xiàn)2次較大值，分別為2．20%、2．17%;18/18結(jié)合部死亡率在第15天出現(xiàn)最大值，值為6．42%，是同時(shí)期4/18號(hào)結(jié)合部死亡率的2．96倍。可見，4/18嫁接體成活率要高于18/18嫁接體成活率，且結(jié)合部成活的關(guān)鍵期在嫁接后的半個(gè)月內(nèi)。

2．2 嫁接組合的理化指標(biāo)

2．2．1 SOD活性

從表1可以看出:4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部的SOD活性在嫁接后24 h內(nèi)均呈現(xiàn)先下降后上升再下降再上升的趨勢，嫁接后第3天至第55天先下降后上升最后趨于穩(wěn)定;嫁接后0 h～55 d(除第25天)，4/18結(jié)合部的SOD活性均低于18/18結(jié)合部;前24 h內(nèi)差值均較大，差值最大出現(xiàn)在嫁接后第4小時(shí)，達(dá)到116%;4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部在嫁接后SOD活性均出現(xiàn)3次較大值。4/18結(jié)合部分別在嫁接后第11小時(shí)、第24小時(shí)、第5天出現(xiàn)較大值;18/18結(jié)合部分別在嫁接后第6小時(shí)、第24小時(shí)、第7天出現(xiàn)較大值;4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部在嫁接后SOD活性值最低點(diǎn)都出現(xiàn)在嫁接后第15天。表明嫁接后24 h內(nèi)SOD活性變化劇烈，結(jié)合部可能已經(jīng)形成愈傷組織，嫁接后第15天接穗的愈傷組織與砧木的愈傷組織可能已經(jīng)連接。

2．2．2 CAT活性

嫁接后24 h內(nèi)，2個(gè)嫁接組合CAT活性均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，4/18結(jié)合部CAT活性均要高于18/18結(jié)合部的(除第0、24小時(shí)外);嫁接后24 h至55 d，2個(gè)嫁接組合CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;嫁接后24 h至第9天，4/18結(jié)合部CAT活性值開始低于18/18結(jié)合部的(除第5天外);4/18結(jié)合部，分別在第6小時(shí)、第5天、第25天出現(xiàn)3次較大值，18/18結(jié)合部在嫁接后的第3、7天出現(xiàn)2次較大值(表1)。在第3天，18/18結(jié)合部可能已經(jīng)形成了大量的愈傷組織;在第25天，4/18結(jié)合部可能已經(jīng)充分愈合。

2．2．3 POD活性

在嫁接后24 h內(nèi)4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢;而4/18結(jié)合部POD活性出現(xiàn)了5次較大值，分別在嫁接后4 h、11 h、24 h、7 d、25 d;而18/18結(jié)合部的POD活性變化平緩，分別在第6小時(shí)、第3天、第35天出現(xiàn)3次較大值(表1)。嫁接后24 h內(nèi)，由于對(duì)機(jī)體機(jī)械傷害起保護(hù)作用，POD活性值變化劇烈;4/18結(jié)合部嫁接后第7天可能是愈傷組織的接觸時(shí)期，嫁接后第25天、第35天可能分是別4/18嫁接體、18/18嫁接體愈傷組織分化維管束的高峰時(shí)期，這一時(shí)期4/18嫁接體要早于18/18嫁接體，并有可能于這一時(shí)期形成貫通砧木和接穗的維管束橋。

2．2．4 MDA質(zhì)量摩爾濃度

在嫁接后24 h內(nèi)，4/18結(jié)合部在第6小時(shí)出現(xiàn)第1次較大值，18/18結(jié)合部出現(xiàn)2次較大值，分別為第4小時(shí)和第16小時(shí);4/18結(jié)合部MDA質(zhì)量摩爾濃度在嫁接后24 h至55 d內(nèi)均低于18/18結(jié)合部(除第5天、第15天)且都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最后恢復(fù)至起始水平，并且都出現(xiàn)一個(gè)較大值，分別為第15天和第25天(表1)。表明，在嫁接后24 h內(nèi)，愈傷組織可能已經(jīng)出現(xiàn);4/18結(jié)合部在第15天和18/18結(jié)合部在第25天死亡率過高可能與膜質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

表1 油茶不同芽苗砧嫁接組合死亡率及生理指標(biāo)

2．2．5 可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如表1所示:在嫁接后24 h內(nèi)4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，在第11小時(shí)出現(xiàn)第1次較大值，而18/18結(jié)合部可溶糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降的趨勢;嫁接后24 h至55 d，2個(gè)嫁接組合結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈先上升后下降的趨勢，且嫁接后第24小時(shí)至第25天，4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)要低于4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第15天出現(xiàn)一次較大值，18/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在第3天、第7天、第15天出現(xiàn)3次較大值。

2．2．6 可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如表1所示:嫁接后，4/18結(jié)合部可容性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均要高于18/18結(jié)合部(除0 h);在嫁接24 h內(nèi)，4/18結(jié)合部呈下降的趨勢，而18/18結(jié)合部可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后升高再下降再升高的趨勢;在嫁接24 h后，2個(gè)嫁接組合均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。2個(gè)嫁接組合在第15天后可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)都逐步上升，這可能與這一時(shí)期維管束開始分化并且逐步形成砧穗間的維管束橋有關(guān)。

2．3 嫁接組合理化指標(biāo)間的相關(guān)性

從表2中可以看出，4/18嫁接體死亡率與其他指標(biāo)相關(guān)程度大小為:可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞MDA質(zhì)量摩爾濃度＞可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞SOD活性＞POD活性＞CAT活性。死亡率與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)達(dá)－0．73，呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA質(zhì)量摩爾濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0．65，與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，與SOD活性呈負(fù)相關(guān)，與POD活性呈正相關(guān)。POD活性與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。18/18嫁接體死亡率與其他指標(biāo)相關(guān)程度大小為:可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞MDA質(zhì)量摩爾濃度＞SOD活性＞POD活性＞CAT活性。死亡率與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)達(dá)－0．49，呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA質(zhì)量摩爾濃度呈顯著正相關(guān)，與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0．62，與SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與POD呈正相關(guān)。POD活性與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。

表2 油茶芽苗砧嫁接組合結(jié)合部生理指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系

3 結(jié)論與討論

在親和性研究中，成活率是判斷嫁接親和力的常用指標(biāo)，可以作為判斷砧穗組合的短期嫁接親和性［14］。在該試驗(yàn)中4/18，嫁接體成活率要明顯高于18/18嫁接體成活率且結(jié)合部成活的關(guān)鍵期在嫁接后的半個(gè)月內(nèi)，與馮金玲等［15］對(duì)油茶嫁接體親和性的研究一致;在較親和的嫁接體結(jié)合部中SOD、POD酶活性高峰出現(xiàn)的時(shí)間較早，這與蘇媛［7］對(duì)黃瓜嫁接體的研究結(jié)果一致;并且在較親和的嫁接體結(jié)合部的SOD活性較低，POD活性要高，這分別與曲云峰［16］在大扁杏(Prunus armeniaca×sibirica)上的研究和嚴(yán)毅等［17］在葡萄柚(Citrus paradisi)上的研究結(jié)果一致;而嫁接結(jié)合部CAT活性與嫁接體親和性沒有一定的聯(lián)系，不能直接作為反映嫁接體親和性關(guān)系的指標(biāo)。

嫁接體愈傷組織的形成需要大量的糖類物質(zhì)［18］，并且在水分脅迫下，其含量隨脅迫程度的加深而呈增大的趨勢［19］。在嫁接后1～15 d，18/18嫁接體的死亡率和可溶性糖含量都呈逐步上升趨勢并高于4/18嫁接體，可能與嫁接體結(jié)合部愈傷組織的形成與分化有關(guān)，也可能因?yàn)榧藿雍蠹藿芋w發(fā)育前期砧穗并未愈合，而18/18嫁接組合的接穗葉片較大，受水分脅迫更嚴(yán)重有關(guān)。

可溶性蛋白的積累與細(xì)胞的分裂活動(dòng)有關(guān)，嫁接口的愈合需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，以增進(jìn)嫁接后細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成［6］。本試驗(yàn)結(jié)果表明:4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢與嫁接體愈合階段有關(guān);在愈合前期由于蛋白質(zhì)在代謝過程中的合成代謝速度慢于分解代謝的速度，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，而在嫁接體愈合后期，當(dāng)砧穗間維管束橋形成，砧穗融為一個(gè)整體后進(jìn)入了正常的生長發(fā)育階段，嫁接體中的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始逐漸增加，在較親和的嫁接體結(jié)合部的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

MDA是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，其積累是自由基毒害作用的表現(xiàn)［7］，同時(shí)可以作為判斷植物對(duì)逆境條件反應(yīng)強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)［20］。4/18結(jié)合部MDA質(zhì)量摩爾濃度與嫁接體死亡率呈極顯著正相關(guān)，18/18結(jié)合部MDA質(zhì)量摩爾濃度與嫁接體死亡率呈顯著正相關(guān)，并且在較親和的嫁接體結(jié)合部的MDA質(zhì)量摩爾濃度的高峰較早，含量較低。

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