溫　娜，張巧玉，王振國

(解放軍第三〇九醫(yī)院婦產科，北京 100091)

細胞因子信號轉導抑制因子3在早產和足月產胎盤組織中的不同表達

溫娜，張巧玉，王振國※

(解放軍第三〇九醫(yī)院婦產科，北京 100091)

早產是引起圍生兒發(fā)病率和病死率升高的重要因素，是妊娠期常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率為5%～15%，如何有效避免早產，為優(yōu)生優(yōu)育提供指導，具有重要的臨床意義[1]。細胞因子信號轉導抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)是近年來發(fā)現的免疫抑制因子家族，有研究提示足月妊娠產程發(fā)動與其密切相關[2]。因此,進一步深入研究SOCS3在早產患者中的表達及分布情況，可能進一步揭示早產發(fā)病的免疫學機制。因此，本研究主要分析SOCS3在早產和足月產胎盤組織中的不同表達，探討其在早產發(fā)生中的意義，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年2~10月解放軍第三〇九醫(yī)院收治的自發(fā)性早產患者(早產組)及足月妊娠婦女(足月組)各30例，同時根據分娩方式不同各自分為經陰道產組和剖宮產組，各15例。早產組選擇標準按第6版《婦產科學》標準執(zhí)行，足月組為無產科并發(fā)癥及內科合并癥患者，以獲取兩組婦女妊娠后的胎盤組織作為研究材料。其中早產組年齡20～37歲,平均(28±4)歲；孕周為28～35周,平均(32.0±2.3)周。足月組年齡20～38歲,平均(26±6)歲；孕周為37～41周,平均(38.0±1.7)周。兩組孕婦在年齡、孕周等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審查，兩組孕婦均簽署相關知情同意書。

1.2樣本采集胎盤娩出后，于胎盤母體面中央切邊長0.5 cm、厚0.5 cm的四邊形組織塊；胎膜選擇胎膜靠近子宮側剝取一層膜；臍帶于臍帶根部2 cm處選取組織切塊。全部新鮮標本于24 h內甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋行4 μm厚度的連續(xù)切片，行病理形態(tài)學檢查。

1.3免疫組織化學方法定位SOCS3分布采用EnVision法免疫組織化學技術行SOCS3染色(丹麥Dako公司試劑盒)，陽性對照采用已知的陽性片，陰性對照采用PBS代替一抗，標本的分級及觀察采用雙盲法，由固定兩名病理副主任醫(yī)師審定，SOCS3蛋白表達強度(-)和(+)為陰性，以(++)和(+++)為陽性判斷。判斷標準參照[3]：對標本中的標本中陽性細胞百分比及染色強度進行綜合評分，陽性細胞百分比為5個高倍鏡(10×40)隨機視野的陽性細胞百分比，根據著色強度記分：0分為無色，1分為弱(淺黃色)，2分為中(棕黃色)，3分為強(棕褐色)。再根據陽性細胞百分比記分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為陽性細胞11%～50%，3分為陽性細胞51%～80%，4分為陽性細胞>80%。最后得分=著色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.4Western blot檢測胎盤組織中SOCS3蛋白表達收集新鮮組織，切成小塊，加入含抑制劑的蛋白裂解液，用勻漿器低速勻漿，提取總蛋白，Braford法測定蛋白濃度。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法行電泳分離，槽式濕轉法轉膜，免疫雜交染色。以β肌動蛋白為內參蛋白，采用天能凝膠圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶吸光度(A)光度。

1.5反轉錄聚合酶鏈反應法檢測SOCS3-mRNA在胎膜中的表達選取新鮮胎盤組織(組織樣本同上)，勻漿器打勻，加入1 mL TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司)，室溫靜置5 min，根據操作說明提取總RNA，按Permentas公司逆轉錄說明書，逆轉錄cDNA，進行針對目的基因的聚合酶鏈反應。以β肌動蛋白基因為內參觀察目的基因。采用天能凝膠圖像分析系統(tǒng)讀取各條帶吸光度(A)光度，基因序列詳見表1。

表1　PCR引物序列

PCR：聚合酶鏈反應；SOCS3：細胞因子信號轉導抑制因子3

2結果

2.1兩組胎盤組織中SOCS3蛋白表達情況比較早產組所有患者SOCS3蛋白均表達陽性或強陽性，足月組其蛋白表達程弱陽性或陰性，使用高倍顯微鏡觀察早產組SOCS3蛋白主要表達于細胞核和細胞質，見圖1；足月組主要表達于細胞質，見圖2。早產組在絨毛、臍帶和胎膜中SOCS3蛋白的表達均高于足月組(均P<0.01)；組間比較，足月組和早產組阻道產和剖宮產亞組SOCS3蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1　胎膜中細胞因子信號轉導抑制因子3表達1A：早產組；1B：足月組(免疫組織化學，×40)

組別例數絨 毛陰道產(n=15)-++++++陽性(%)剖宮產(n=15)-++++++陽性(%)足月組30113101(6.7)212101(6.7)早產組30009615(100.0)007815(100.0)T132.0123.5P0.0000.000組別例數臍 帶陰道產(n=15)-++++++陽性(%)剖宮產(n=15)-++++++陽性(%)足月組30113101(6.7)113101(6.7)早產組30029413(86.7)0110414(93.3)T139.5120.5P0.0000.000組別例數胎 膜陰道產(n=15)-++++++陽性(%)剖宮產(n=15)-++++++陽性(%)足月組30211202(13.3)212101(6.7)早產組300031215(100.0)0011415(100.0)T123.0120.5P0.0000.000

SOCS3:細胞因子信號轉導抑制因子3;a與足月組比較，P<0.05

2.2兩組胎盤組織中SOCS3-mRNA基因表達情況早產組SOCS3-mRNA基因相對表達量為1.28±0.17，足月組為0.61±0.19，早產組SOCS3基因表達較足月組顯著增強(t=23.43，P<0.01),見圖2。

圖2　足月產和早產胎盤組織中細胞因子信號轉導

3討論

早產是導致孕產婦和圍生兒病率及病死率升高的重要原因之一[4]。因此，明確早產的原因對臨床早產的治療和預防具有重要的理論及實踐意義。近年來研究表明，妊娠是一種成功的同種異體移植現象，其成功有賴于妊娠母體的免疫耐受，這種耐受一旦被破壞，則導致病理妊娠，如流產、早產等[5]。本研究結果顯示，SOCS3在所有早產患者中均有不同程度的表達，無論絨毛、胎膜或臍帶均有表達，其陽性表達率為100%，但在足月產孕婦中其表達率卻明顯較低，說明SOCS3在產程的啟動、發(fā)生和進程中具有一定作用。

SOCS是近幾年發(fā)現的一類新型免疫分子，包括SOCS1~7和細胞因子誘導序列等類型，SOCS3作為SOCS家族中的重要成員，是現階段此家族成員中研究最為廣泛和深入的一種[6-7]。SOCS3可表達于多種細胞中，主要通過以下3種途徑影響細胞因子的信號轉導：①通過抑制JAK激酶活性阻斷酪氨酸激酶-轉錄因子信號通路(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathway,JAK-STAT)通路；②與細胞因子受體結合，阻斷STAT活性；③通過增加蛋白酶體的活性，加速JAK-STAT途徑信號蛋白的水解。SOCS3通過以上機制影響白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等多種細胞因子的信號轉導，并在T細胞的分化和免疫調控中扮演重要角色，是機體固有免疫和獲得性免疫的重要調節(jié)因子。本研究結果顯示，早產組SOCS3的胎膜中基因表達明顯較足月組增強，提示其可能通過JAK-STAT通路，調劑體內免疫平衡，激發(fā)產程提前啟動[8]。

目前已有研究表明在足月妊娠的絨毛、蛻膜以及胎盤等組織中均表達SOCS的mRNA，然而在部分學者研究認為SOCS蛋白表達僅在胎盤和極少數的蛻膜組織中[9-10]。另有學者發(fā)現，在流產的妊娠組織中SOCS的mRNA和蛋白表達

一致，但并未發(fā)現SOCS蛋白表達的降低[11]。本研究結果顯示，胎膜中SOCS3的基因及蛋白表達水平一致，同時發(fā)現足月組同既往研究[9]一樣絨毛、胎膜等組織間SOCS表達差異無統(tǒng)計學意義，但在早產孕婦中，胎膜的強陽性率較其同組中臍帶及絨毛中表達增高，這可能與胎盤的保護機制存在關系，需要進一步探索。本研究比較不同分娩方式的SOCS3表達，結果顯示SOCS3的表達與分娩方式無關。

關于SOCS3蛋白在早產中的意義還需要進一步探索，就目前研究結果可以推測，SOCS3在早產的發(fā)生中具有一定意義，同時其作用機制可能是通過JAK/STAT信號途徑干預體內調節(jié)免疫平衡。本研究為進一步深入探討SOCS在早產中的臨床意義奠定了基礎，為今后早產的臨床防治起到積極的指導作用。

參考文獻

[1]任黎明,郭宏.早產兒免疫功能檢測的臨床意義[J].實用醫(yī)藥雜志,2006,23(5):567-568.

[2]Li Y,de Haar C,Peppelenbosch MP,etal.SOCS3 in immune regulation of inflammatory bowel disease and inflammatory bowel disease-related cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2012,23(3):127-138.

[3]葉偉萍，楊祖菁.NF-κB p65在早產和足月產胎盤組織中的不同表達[J].中國醫(yī)師雜志，2010,12(11)：1494-1496.

[4]Alcazar MA,Boehler E,Rother E,etal.Early postnatal hyperalimentation impairs renal function via SOCS-3 mediated renal postreceptor leptin resistance[J].Endocrinology,2012,153(3):1397-1410.

[5]Yoshimura A,Suzuki M,Sakaguchi R,etal.SOCS,Inflammation,and Autoimmunity[J].Front Immunol,2012,3:20.

[6]Sennstrom MB,Ekman G,Westergren-Thorsson G,etal.Human cervical ripening,an inflammatory process mediated by cytokines[J].Mol Hum Reprod,2000,6(4):375-381.

[8]Croker BA，Kiu H，Nicholson SE.SOCS regulation of the JAK/STAT signaling pathway[J].Semin Cell Dev Biol，2008，19(4)：414-422.

[9]Blumenstein M，Keelan JA，Bowen-Shauver JM，etal.Suppressors of cytokine signaling proteins in human preterm placental tis-sues[J].J Mol Endocfinol，2005,35(1)：165-175．

[10]邢長英，歸綏琪，王海燕．細胞因子信號抑制因子3(SOCS3)在先兆流產絨毛和蛻膜組織中的表達[J]．生殖和避孕，2008，28(11)：660-664．

[11]Buun C，Heding PE，Rnn SG，etal．Suppressor of cytokine signalling- 3 inhibits tumor necrosis factor-alpha induced apoptosis and signalling in betacells[J]．Mol Cell Endocrinol，2009，311(1/2)：32-38．

摘要：目的分析細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS3)在早產和足月產胎盤組織中的表達，探討該因子在早產發(fā)生中的意義。方法選取2013年2~10月解放軍第三〇九醫(yī)院收治的自發(fā)性早產患者30例(早產組)，足月妊娠婦女30例(足月組)，兩組依據分娩方式的不同各分為陰道產、剖宮產，各15例，收集患者的絨毛、臍帶、胎膜的胎盤組織，應用免疫組織化學法檢測兩組孕婦各胎盤組織中的SOCS3蛋白表達情況；半定量聚合酶鏈反應法檢測SOCS3-mRNA在胎膜的表達情況，比較2組以及組織部位間SOCS3蛋白及基因表達強度。結果早產組所有患者SOCS3蛋白均表達陽性或強陽性，足月組蛋白表達程弱陽性或陰性，其中早產組SOCS3蛋白主要表達于細胞核和細胞質，足月組主要表達于細胞質；早產組絨毛、胎膜、臍帶中SOCS3蛋白表達陽性率顯著強于足月組對應組織(P<0.01)。結論SOCS3蛋白表達強度與早產的發(fā)生、發(fā)展機制存在一定的聯(lián)系，但與分娩方式無關。

關鍵詞：早產；細胞因子信號轉導抑制分子3；蛋白

Expression of Suppressors of Cytokine Signaling 3 in Placental Tissue between Premature Delivery and Full Term DeliveryWENNa，ZHANGQiao-yu，WANGZhen-guo.(DepartmentofGynecologyandObstetrics,ChinesePLA309thHospital,Beijing100091,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the expression of suppressors of cytokine signaling 3(SOCS3) in placental tissue of premature delivery and full term delivery,and to evaluate significance of the factor in premature delivery.MethodsRetrospective analysis was made on 30 patients as premature group who had spontaneous premature delivery and 30 pregnant women as full term group with normal delivery from Feb.to Oct.2013 in Chinese PLA 309th Hospital．Each group included vaginal delivery and cesarean section,15 cases respectively.The placenta tissue of villi,umbilical cord,membranes were collected,and the expression of SOCS3 protein in the above tissues was analyzed by immunohistochemistry method.RT-PCR was used to detect the expression of SOCS3-mRNA.The intensity of SOCS3 protein expression between different and tissues were compared.ResultsSOCS3 protein in all cases of premature delivery group were positive or strong positive,while weakly positive or negative in full term delivery group; SOCS3 protein expression was mainly in the nucleus and cytoplasm in premature delivery group,while was mainly expressed in the cytoplasm in full term delivery group; SOCS3 protein expression in the villi，umbilical cord and fetal membranes in the premature delivery group was stronger than full term delivery group;SOCS3 protein expression on fetal membrane was higher than villi，umbilical cord in the premature delivery group;SOCS3-mRNA expression in premature delivery group was significantly higher than the full term delivery group(allP<0.01).ConclusionThe intensity of SOCS3 protein expression has a certain correlation with occurrence and development of premature delivery,but it has no correlation with the way of delivery.

Key words：Premature delivery; Suppressors of cytokine signaling 3; Protein

收稿日期：2014-09-22修回日期：2015-01-17編輯：伊姍

基金項目：解放軍第三〇九醫(yī)院課題(2013MS-012)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.051

中圖分類號：R714.7

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)15-2828-03