白辰 車念聰 劉文蘭 趙暉 司遠

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指以膠原纖維 為主的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝內大量沉積的病理過程［1］。與拮抗纖維化的西藥相比，中藥復方在對病人個體治療方面具有一定優(yōu)勢。滋陰疏肝的時方一貫煎為臨床常用治療肝纖維化的方劑。本課題組前期實驗研究表明［2］，一貫煎湯劑能有效降低血清轉氨酶含量，減輕肝臟炎癥程度。本研究擬通過建立CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型，觀察經一貫煎湯劑干預后，肝組織細胞外I型膠原沉積情況的變化，探討一貫煎湯劑對降解細胞外I型膠原沉積是否有促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

選用健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，體質量180～200 g，鼠齡8周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(京)2012-0001，共28只，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學實驗動物科學部SPF級動物室。

一貫煎:根據(jù)原方藥物劑量和比例［3］，選取北京同仁堂藥店的標準中藥材北沙參9 g、麥冬9 g、當歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，煎煮為湯劑。按照體表面積計算，大鼠每100 g體質量所需生藥為0.65 g，將一貫煎湯劑按照100 g大鼠灌胃1mL的體積配成相應濃縮液備用。

CCl4(四氯化碳分析純專用試劑，純度≥99.5%，北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司，批號:20060132)，橄欖油(阿果薩特級初榨橄欖油，最大酸度0.4%，批號:14001952)，秋水仙堿(西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司生產，批號:120412)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號:20729509)，蛋白定量試劑盒(北京蒂諾奧生物科技有限公司)，一抗:Anti-Collagen I antibody ab34710(美國 abcam)、蛋白質印跡法二抗:Dylight 800-goat anti-rabbit IgG(美國 Earthox LLC)，二抗:Polink-2 plus@Polymer HRP Detection System(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-9001)。

1.2 儀器設備

酶標儀(Bio-Rad，Model680，美國)垂直電泳槽(Bio-Rad，美國)，小型電泳儀(Bio-Rad，美國)，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(Li-Cor，美國)，熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)，恒溫箱(Sanyo)。

1.3 造模

適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組，模型組，西藥組，中藥組。除正常組外，其余3組大鼠腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液(0.2 mL/100 g)，每周2次，共2周;隨后腹腔注射0.1 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周 2次，共 2周;接著腹腔注射0.05 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周2次，共2周。正常組大鼠以同樣方式等劑量腹腔注射橄欖油溶液。

1.4 治療

從第7周開始，停止腹腔注射，中藥組予一貫煎濃縮液1 mL/100 g灌胃，西藥組給予秋水仙堿灌胃，0.25 mg/kg(相當于成人用量的 30 倍)［4］。正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)4周。

1.5 采集及處理樣品

治療4周后，所有大鼠以10%水合氯醛按0.35 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉。取肝左葉同一部分，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟至水，自來水洗5分鐘，蒸餾水洗5分鐘?？乖迯秃?，滴入適當一抗(1∶800)，37度孵育90分鐘，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.6)洗3次，每次2分鐘。滴入適當二抗，37℃孵育20分鐘，pbs洗3次，每次3分鐘，室溫顯色。蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。采用NIS-Elements BR 3.2采集圖像，進行積分光密度分析。每組隨機選取3個樣本，取肝右葉50～100 g，剪碎勻漿后蛋白定量，5%濃縮膠80 V電泳約30分鐘，10%分離膠120 V電泳至溴酚藍到底。60 mA冰浴過夜轉膜，封閉后一抗(1∶10000)室溫搖床孵育 1小時，洗膜后二抗(1∶10000)室溫搖床孵育1小時，洗膜后掃描成像，采用Imagej2x分析蛋白電泳灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計處理，各組計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01視為差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。采用Origin 8繪制統(tǒng)計圖。

2 結果

正常組大鼠肝組織僅在中央靜脈及匯管區(qū)周圍可見極少量I型膠原沉積。與正常組相比，模型組大鼠I型膠原蛋白表達增加，在肝組織中央靜脈及匯管區(qū)周圍、橋接結構中可見大量I型膠原沉積，且散見于小葉各處。與模型組相比，西藥組與中藥組I型膠原表達減少，肝組織細胞外I型膠原沉積明顯減少，在中央靜脈及匯管區(qū)周圍有部分I型膠原沉積。見圖1、圖2、表1。

圖1 各組大鼠肝組織I型膠原免疫組化染色(×400)

圖2 各組大鼠肝組織I型膠原蛋白表達

表1 各組大鼠肝組織I型膠原情況(x±s)

3 討論

一貫煎始載自清·魏玉璜所著《續(xù)名醫(yī)類案》，由生地黃、沙參、當歸、枸杞、麥冬、川楝子組成，功擅滋陰疏肝，臨床常用于治療肝腎陰虛、肝郁氣滯所致脅痛、口干、腰膝酸軟等癥狀。根據(jù)HF的臨床表現(xiàn)和病癥特點，中醫(yī)學可參考“脅痛”、“肝積”“臌脹”“黃疸”等病證范疇。其病因多為飲食失節(jié)、情志失常、勞傷虛損、感染蟲毒等，致濕熱邪毒內蘊，傷陰耗氣，痰凝血瘀，損傷肝絡，發(fā)為此病［5］。因肝腎二臟母子相及，乙癸同源，故肝纖維化病變后期往往出現(xiàn)肝腎陰虛的證候［6-7］。一貫煎方中重用生地黃為君藥，滋陰養(yǎng)血，補益肝腎;以沙參、當歸、枸杞、麥冬4藥共為臣藥，滋陰柔肝;同時少佐川楝子疏肝泄熱，諸藥合用，既滋補肝腎之陰又疏理肝氣，使肝陰得養(yǎng)，肝氣得舒。

包括蛋白多糖、膠原蛋白和黏連蛋白［8］在內的ECM代謝紊亂會導致肝臟結構和功能出現(xiàn)異常，其中I型膠原蛋白變化幅度最大［9］，可作為肝臟內膠原代謝變化的參考。正常肝組織細胞外間質的I型膠原主要分布在匯管區(qū)和中央靜脈周圍，研究表明［10-11］，I型膠原由激活的肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)合成及分泌，受基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)調節(jié)。本實驗結果表明，模型大鼠肝組織I型膠原蛋白表達增加，在肝組織細胞外沉積增多，反映出CCl4誘導大鼠肝纖維化過程中出現(xiàn)I型膠原代謝紊亂，過度沉積。經一貫煎湯劑治療后，肝組織內沉積的I型膠原明顯減少。前期研究表明，I型膠原減少的原因考慮與調節(jié)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)信號通路凋亡細胞抑制劑(cellular inhibitors of apoptosis，cIAP1)蛋白［12］，促進骨髓間充質干細胞募集到肝臟［2］，調節(jié)MMP-1/TIMP-1有關。目前抗肝纖維化的現(xiàn)代藥物研究主要集中于逆轉纖維化的多種靶點，包括MMPs/TIMPs、TGF-β 細胞因子、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4、內源性大麻素(endogenous cannabinoids，EC)及其受體、整合素αV、微小RNA-29在內的多種潛在靶點，大部分仍處于臨床前研究階段［13］，應用一貫煎湯劑等中藥復方拮抗肝纖維化的研究可為肝纖維化的治療提供新的思路。

本實驗結果提示:一貫煎湯劑能降低I型膠原在肝細胞外的沉積;同時提示一貫煎疏肝理氣的功用可能與其減少肝組織內I型膠原，進而改善臟器結構有關。本實驗為闡釋一貫煎對肝纖維化的拮抗作用提供了一定的數(shù)據(jù)支持，為臨床合理應用一貫煎治療相關疾病起到一定的指導作用。

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(本文編輯:董歷華)