張佳楠，常開文，李 瓊，孫 凱，尹升燕，吳長鋒

(集成光電子學(xué)國家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)區(qū)吉林大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130012)

1 引 言

熒光成像技術(shù)是生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究工具［1-2］。新型熒光成像技術(shù)可以在單分子水平上探測生物分子間的相互作用，也可以對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行納米分辨率的成像;另外還可用于監(jiān)測基因表達(dá)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和信號傳導(dǎo)等細(xì)胞活動(dòng)［3-7］。熒光探針的亮度和穩(wěn)定性是決定熒光成像技術(shù)的靈敏度和檢測限的重要因素。傳統(tǒng)的有機(jī)染料分子做熒光標(biāo)記時(shí)，其熒光亮度低和光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)已經(jīng)限制了現(xiàn)代熒光成像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，開發(fā)新型熒光標(biāo)記材料及技術(shù)成為化學(xué)、材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

在近十幾年中，熒光納米粒子在材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［8-9］。其中小尺寸的熒光納米粒子在生物學(xué)應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，為此人們開發(fā)了各式各樣的小尺寸量子點(diǎn)(Quantum dots，Qdots)，如無機(jī)半導(dǎo)體量子點(diǎn)、硅量子點(diǎn)、碳量子點(diǎn)和摻雜了染料的二氧化硅納米粒子等［10-13］。經(jīng)過表面包覆和生物功能化，無機(jī)量子點(diǎn)已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)成像研究中展示了重要應(yīng)用［14-15］。以CdSe/ZnS為代表的無機(jī)半導(dǎo)體量子點(diǎn)由于量子尺寸效應(yīng)而表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)特性，而且可以通過調(diào)整量子點(diǎn)的尺寸獲得各種發(fā)射波長。這種納米標(biāo)記探針具有吸收譜帶寬、發(fā)射譜帶窄、光譜對稱、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等性質(zhì)。CdSe/ZnS量子點(diǎn)可以克服有機(jī)小分子染料光穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，但是無機(jī)半導(dǎo)體材料一般含有重金屬離子，其天然的毒性大大限制了這類量子點(diǎn)在生物活體成像和臨床醫(yī)學(xué)的實(shí)際應(yīng)用。

有機(jī)半導(dǎo)體聚合物是一類因共軛電子而產(chǎn)生半導(dǎo)體性質(zhì)的高分子材料，已被廣泛應(yīng)用于光電器件［16-17］。近年來，半導(dǎo)體聚合物在高靈敏的化學(xué)和生物傳感器領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用［18-20］。半導(dǎo)體聚合物具有光學(xué)吸收截面大、熒光量子效率高、輻射躍遷速率快等特性，這些優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)特別適合于開發(fā)生物應(yīng)用方面的納米熒光探針。目前人們已經(jīng)開發(fā)了各種疏水聚合物、親水聚合物和兩親性聚合物的熒光納米粒子［21-25］。這些聚合物納米粒子的熒光特性和膠體穩(wěn)定性依賴于其自身的尺寸、組分、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面特性等。

在眾多種類的半導(dǎo)體聚合物納米粒子中，尺寸大小和Qdots相當(dāng)?shù)陌雽?dǎo)體聚合物納米粒子通常被稱為聚合物量子點(diǎn)(Polymer dots，Pdots)［26］。這些小尺寸高亮度的聚合物量子點(diǎn)可以通過表面功能化與生物分子偶聯(lián)，從而在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用［27-33］。本文概述了聚合物量子點(diǎn)的制備方法、熒光性質(zhì)、表面功能化以及在生物應(yīng)用等領(lǐng)域最近的進(jìn)展。重點(diǎn)介紹聚合物量子點(diǎn)在細(xì)胞標(biāo)記、體內(nèi)成像、生物傳感、單粒子示蹤、藥物輸送和光動(dòng)力學(xué)療法等領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖1 常見的半導(dǎo)體聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of common semiconducting polymers

2 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)

通常情況下，在具有π-共軛結(jié)構(gòu)的高分子中，電子云重疊使得π電子可以沿主鏈移動(dòng)。這些π-共軛聚合物在本征態(tài)通常是寬帶隙的半導(dǎo)體，因此可以稱它們?yōu)榘雽?dǎo)體聚合物。這種聚合物的熒光特性可以用半導(dǎo)體能帶理論來解釋:在光激發(fā)下，電子從最高占據(jù)能帶躍遷到最低空能帶，被激發(fā)的電子和空穴形成了束縛態(tài)(激子);電子-空穴對的帶間輻射復(fù)合導(dǎo)致輻射出光子。半導(dǎo)體聚合物的吸收波長由禁帶寬度決定，因此通過改變聚合物的分子結(jié)構(gòu)，人們可以獲得可調(diào)吸收波長的半導(dǎo)體聚合物。目前開發(fā)出的半導(dǎo)體聚合物納米粒子的發(fā)射波長可以遍及可見光譜［34］。

圖1是近幾年研究較多的幾種半導(dǎo)體聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.1 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)的制備

一般來說，Pdots可以從低分子量的單體合成，也可以從高分子量的聚合物直接制備［35-37］。前者通常采用過渡金屬催化偶聯(lián)反應(yīng)來獲得，相比之下，后者可以直接使用市售的半導(dǎo)體聚合物，而且不需要特定的儀器設(shè)備和有機(jī)高分子合成方面的專業(yè)技術(shù)。目前，Pdots主要采用后一種方法制備。從高分子量的聚合物直接制備Pdots的典型方法包括微乳液法和再沉淀法。由于Pdots目前主要應(yīng)用于生物學(xué)研究中，因此最后的溶劑通常選擇水。在不同的制備方法中，半導(dǎo)體聚合物溶液的初始有機(jī)溶劑有一定的區(qū)別:在微乳液法中，半導(dǎo)體聚合物納米粒子是在乳化液液滴中形成的，這就要求初始有機(jī)溶劑是不溶于水的;在再沉淀法中，半導(dǎo)體聚合物溶液迅速與水混合，這就需要一個(gè)與水混溶的初始有機(jī)溶劑。Landfester等［38-39］首次采用微乳液法制備了半導(dǎo)體聚合物納米粒子。他們在制備過程中將半導(dǎo)體聚合物溶解在與水不互溶的有機(jī)溶劑(如氯仿)中，這種有機(jī)溶劑與添加了表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)的水混合之后，將有機(jī)溶劑蒸發(fā)，可以獲得穩(wěn)定的聚合物納米粒子的水溶液。Masuhara等［40］使用再沉淀法制備了聚噻吩納米粒子，后來Mc-Neill研究組［27-30］將這種方法進(jìn)行改良后，首次制備了可以作為高亮度成像探針的Pdots。在再沉淀過程中，溶解聚合物的有機(jī)溶劑迅速與水混合，混合后聚合物溶解度突然下降，在聚合物鏈間或單鏈段之間疏水作用的影響下，最終形成了高熒光亮度的Pdots懸浮液。

2.2 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)的表面功能化

為了使Pdots應(yīng)用于實(shí)際的生物學(xué)研究，還需要對其進(jìn)行表面功能化。類似于Qdots的功能化方法，最初的研究是利用包覆的方法在納米粒子的表面修飾相應(yīng)的官能團(tuán)，后來發(fā)現(xiàn)這種方法對Pdots的粒徑和單粒子亮度有一定的影響［41］。例如PLGA聚合物或者磷脂包覆的Pdots的尺寸對于細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來說過于巨大，而且這種方法得到的納米粒子中半導(dǎo)體聚合物的含量較少，因此納米粒子的吸收截面受到限制［42］。對于表面包覆二氧化硅的Pdots，2～3 nm厚的二氧化硅外殼可能會在生物環(huán)境中逐漸水解［43］。所以，需要開發(fā)更加有效的方法來實(shí)現(xiàn)Pdots的表面功能化，同時(shí)保證納米粒子尺寸適用于細(xì)胞標(biāo)記。

Chiu課題組［44-45］成功地實(shí)現(xiàn)了針對Pdots的表面功能化，并將其用于特異性的細(xì)胞靶向標(biāo)記研究中。他們將少量具有兩親性功能基團(tuán)的高分子與半導(dǎo)體聚合物預(yù)先共混在有機(jī)溶劑中，再利用聚合物的鏈間相互作用制備了表面帶有功能基團(tuán)的Pdots。Chiu等使用的兩親性梳狀聚合物為PS-PEG-COOH，在前驅(qū)體溶液中保持半導(dǎo)體聚合物PFBT的濃度恒定，使PS-PEG-COOH相對于PFBT的質(zhì)量百分含量控制在10% ～20%，然后利用再沉淀法制備功能化的PFBTPdots。圖2(a)是利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測得的表面修飾的PFBT Pdots流體動(dòng)力學(xué)直徑分布圖，圖2(b)是表面修飾的PFBT Pdots的透射電鏡照片。由圖2(a)和圖2(b)可知上述方法得到的納米粒子粒徑約為15 nm，形貌呈球形。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中通過抗原-抗體或生物素-鏈霉親和素相互作用將功能化的Pdots對細(xì)胞膜的受體分子進(jìn)行特異性標(biāo)記。

圖2 (a)表面修飾的PFBT納米粒子的流體動(dòng)力學(xué)直徑分布圖;(b)表面修飾的PFBT納米粒子的透射電鏡照片。Fig.2 (a)Hydrodynamic diameter of functionalized PFBT Pdotsmeasured by DLS.(b)TEM image of functionalized PFBT Pdots.

在另一研究中，Chiu等［46］發(fā)現(xiàn)Pdots的熒光性質(zhì)與聚合物親水基團(tuán)的含量有很大的依賴關(guān)系。他們合成了3種側(cè)鏈帶有不同數(shù)目羧基的PFBT Pdots(羧基的摩爾分?jǐn)?shù)分別為50%，14%，2%)，研究發(fā)現(xiàn)羧基摩爾分?jǐn)?shù)為50%的Pdots的熒光強(qiáng)度明顯弱于其他兩種Pdots。除了利用預(yù)共混的方式對Pdots進(jìn)行表面功能化之外，還可以通過交聯(lián)的方式將功能性高分子共價(jià)連接到Pdots的表面［47］。值得注意的是，表面修飾的聚合物納米顆粒的單粒子熒光強(qiáng)度、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性等特性會發(fā)生改變，因此需要嚴(yán)格控制Pdots的表面功能化過程［46］。近期，我們課題組采用再沉淀法制備了一種粒徑約為15 nm、表面帶有功能基團(tuán)的含有銪配合物的納米粒子。這種納米粒子在水溶液中的膠體穩(wěn)定性良好，克服了傳統(tǒng)包覆方法制備的納米粒子小分子滲漏的缺陷，并且在生物成像應(yīng)用中，其熒光壽命遠(yuǎn)遠(yuǎn)比生物體的自體熒光壽命長，減少了背景熒光干擾，提高了信噪比［48］。

2.3 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)的基本特性

2.3.1 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)的粒徑和形貌

納米熒光探針的尺寸是其在生物應(yīng)用中的一個(gè)重要考慮因素。納米探針的尺寸過大會導(dǎo)致位阻效應(yīng)，這會減弱納米探針上靶向分子和生物分子相互作用的特異性，因此大多數(shù)生物成像實(shí)驗(yàn)需要尺寸較小的多功能納米生物探針［49-50］。通常再沉淀法可以得到粒徑為5～30 nm的Pdots，這種尺寸的量子點(diǎn)可以很好地應(yīng)用在生物實(shí)驗(yàn)中［43］。在透射電子顯微鏡下，Pdots通常呈現(xiàn)出類似于球形的形貌，這可能是由于聚合物與水分子之間巨大的界面張力主導(dǎo)了其粒徑和形貌［51-52］。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，除了通過改變前驅(qū)體溶液的濃度來控制Pdots的粒徑之外，還可以通過在溶解聚合物的四氫呋喃溶劑中混入不同體積比(0%，30%，50%)的水來分別獲得不同尺寸(16，33，59 nm)的 Pdots［53］。圖3(a)、(b)、(c)分別是16，33，59 nm的Pdots單粒子熒光強(qiáng)度照片。

圖3(d)、(e)、(f)分別是相同實(shí)驗(yàn)條件下相應(yīng)尺寸的Pdots單粒子熒光強(qiáng)度直方圖，藍(lán)色曲線代表擬合曲線，得到它們強(qiáng)度的平均值為別為1 286，4 572，16 401，說明 Pdots的單粒子熒光隨著尺寸的增大而增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對33 nm的Pdots攝取的最多，而16 nm的Pdots在免疫細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)記效率更高。這項(xiàng)研究對在生物成像應(yīng)用中如何選擇合適尺寸的Pdots提供了指導(dǎo)。

圖3 粒徑分別為16 nm(a)、33 nm(b)、59 nm(c)的Pdots的單粒子熒光強(qiáng)度照片(標(biāo)尺為5μm)，以及粒徑分別為16 nm(d)、33 nm(e)、59 nm(f)的Pdots的單粒子熒光強(qiáng)度直方圖。Fig.3 Single-particle fluorescence images of Pdot16(a)，Pdot33(b)，and Pdot59(c)，respectively.Scale bar represents 5 μm.Intensity histograms by analyzing single-particle brightness of hundreds of nanoparticles of Pdot 16(d)，Pdot 33(e)，and Pdot59(f)，respectively.

2.3.2 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)的光物理性質(zhì)Pdots的光譜性質(zhì)與聚合物分子構(gòu)型密切相關(guān)。相對于聚合物分子在有機(jī)溶劑中的吸收光譜，再沉淀法得到的Pdots水溶液的吸收光譜有一定程度的展寬和藍(lán)移［43］，這與聚合物中高分子鏈在彎曲、扭轉(zhuǎn)的過程中引起的共軛骨架長度減少的現(xiàn)象相符合。圖4(a)和圖4(b)分別是幾種常見的Pdots的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。由圖4(a)可知，Pdots有比較寬的吸收帶，在350～600 nm的范圍內(nèi)都有吸收。在一定波長范圍內(nèi)，熒光納米粒子的光吸收能力可以由吸收截面來描述。當(dāng)Pdots的濃度一定時(shí)，粒徑為15 nm的單粒子的吸收截面大約是10-13cm2。這個(gè)數(shù)值在可見光和近紫外區(qū)域內(nèi)是CdSe Qdots吸收截面的十到幾百倍［54］。由圖4(b)可知，各種Pdots在可見光區(qū)域顯示出不同的發(fā)射峰。在大多數(shù)情況下，Pdots水溶液的發(fā)射光譜相對于有機(jī)溶劑中的聚合物的發(fā)射光譜表現(xiàn)出略微的紅移，這是由于聚合物分子鏈塌陷、鏈間的相互作用增加而產(chǎn)生了紅移聚集體［43］。這種紅移現(xiàn)象一般是在薄膜中被觀察到的［55］。

圖4(a)常見的Pdots的吸收光譜;(b)常見的Pdots的發(fā)射光譜;(c)單個(gè)PFBT納米粒子的光漂白軌跡曲線;(d)粒徑約為10 nm的單個(gè)PFBT納米粒子發(fā)射出光子數(shù)量的直方圖。Fig.4 (a)Absorption spectra of common Pdots.(b)Emission spectra of common Pdots.(c)Photobleaching trajectories of single PFBT nanoparticle.(d)Histogram of the photon numbers of individual PFBT Pdots of～10 nm diameter.

單個(gè)納米粒子的熒光亮度是由峰值吸收截面和熒光量子效率決定的。熒光量子效率定義為發(fā)射光子數(shù)目與吸收光子數(shù)目之比，它的值是評估熒光探針性能的標(biāo)準(zhǔn)之一。在早期的報(bào)道中，傳統(tǒng)的聚合物量子點(diǎn)的量子效率為1% ～20%［43］。而Chiu課題組［33］研究的一些新型π-共軛聚合物量子點(diǎn)的熒光量子效率可接近60%，這樣高熒光量子效率的Pdots可以與一些Qdots相媲美。由于Qdots通常具有較厚的殼層結(jié)構(gòu)，一般摻雜染料的納米球由于自猝滅現(xiàn)象導(dǎo)致有效的熒光團(tuán)濃度僅是顆粒體積或重量的百分之幾。相比之下，功能化的Pdots中的有效熒光基團(tuán)濃度可達(dá)到80%以上［45］，可見Pdots是性能優(yōu)異的熒光探針。

典型的熒光染料的熒光輻射速率常數(shù)約為108s-1，Pdots的熒光輻射速率常數(shù)的范圍在108～109s-1［56］。在單分子成像和粒子示蹤實(shí)驗(yàn)中測得的染料分子熒光輻射速率值往往受三線態(tài)飽和的限制。由統(tǒng)計(jì)分析可知，Pdots的飽和輻射速率范圍在107～109s-1，這比典型的熒光染料的平均飽和輻射速率(約為106s-1)至少高出約100倍，比膠體半導(dǎo)體量子點(diǎn)的平均飽和輻射速率至少高出3個(gè)數(shù)量級［54］。擁有較快的熒光輻射速率的Pdots在流式細(xì)胞術(shù)和先進(jìn)的動(dòng)態(tài)成像實(shí)驗(yàn)中有很大的應(yīng)用優(yōu)勢。

熒光染料或者納米粒子的光穩(wěn)定性可以由光漂白量子產(chǎn)率(ΦB)描述。ΦB的值等于給定時(shí)間間隔內(nèi)熒光染料或者納米粒子發(fā)生光漂白的分子數(shù)除以這段時(shí)間內(nèi)吸收的光子總數(shù)。典型的熒光染料的 ΦB范圍一般在 10-4～10-6［57］。Pdots的ΦB值的范圍一般在 10-7～10-10［54］。單粒子的光漂白實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以評估Pdots的光穩(wěn)定性。如圖4(c)所示，綠色曲線代表尺寸較大(＞10 nm)的PFBT Pdots的光漂白曲線，藍(lán)色曲線代表尺寸較小的PFBT Pdots的光漂白曲線。尺寸較大的PFBT Pdots具有較多的發(fā)色團(tuán)，會出現(xiàn)連續(xù)的光漂白現(xiàn)象但卻無明顯的光閃爍;尺寸較小的PFBT Pdots通常表現(xiàn)出比較明顯的熒光閃爍。這表明PFBT的熒光閃爍依賴于納米粒子自身的尺寸［58-59］。如圖4(d)所示，粒徑約為10 nm的單個(gè)PFBT納米粒子的發(fā)射光子約為6×108個(gè)，比單個(gè)無機(jī)量子點(diǎn)的發(fā)射光子數(shù)(約107個(gè))至少高出一個(gè)數(shù)量級［60］。

以往研究較多的兩種常用的熒光探針I(yè)gGAlexa 488和 Qdot 565的發(fā)射波長范圍與PFBT Pdots的發(fā)射波長范圍類似。PFBT Pdots、IgG-Alexa488和Qdot565的幾種光物理性質(zhì)總結(jié)在表1中［45］。從表1可知，PFBT Pdots在488 nm 處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)高于IgG-Alexa 488和Qdot 565。在488 nm激發(fā)下，PFBT Pdots(尺寸約為10 nm)的熒光比相同實(shí)驗(yàn)條件下的IgG-Alexa 488和Qdot 565強(qiáng)得多。

表1 PFBT Pdots，IgG-A lexa 488和Qdot 565的光物理特性Table 1 Photophysical properties of PFBT Pdots，IgG-Alexa 488 and Qdot565

2.3.3 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)的穩(wěn)定性和生物毒性

一般來說，如果Pdots的水溶液不發(fā)生聚集，也不隨著時(shí)間的變化發(fā)生分解，以及與一些生物活性組分共存時(shí)保持良好的化學(xué)穩(wěn)定性，我們就可以認(rèn)為Pdots在生物實(shí)驗(yàn)中是穩(wěn)定的。我們將制備的Pdots水溶液在室溫下放置幾個(gè)月后，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的聚集和沉淀，表明Pdots在水中表現(xiàn)了良好的膠體穩(wěn)定性。然而，Pdots在含有高濃度多價(jià)金屬離子的溶液中傾向于聚集。研究結(jié)果已經(jīng)表明［44-45］，表面修飾可以改善 Pdots的膠體穩(wěn)定性。例如，在Pdots表面涂覆一層聚電解質(zhì)可以使其在高離子強(qiáng)度體系中保持穩(wěn)定［61］。另外，可鈍化 Pdots的添加劑(如牛血清白蛋白(BSA))可以使Pdots保持長期的膠體穩(wěn)定性，同時(shí)降低Pdots在細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的非特異性結(jié)合［45］。BSA鈍化的Pdots在 pH范圍為4～9的環(huán)境中可以保持6個(gè)月或更長時(shí)間的穩(wěn)定性，同時(shí)在許多緩沖液中(HEPES、PBS、Tris以及硼酸鹽緩沖溶液等)也可以保持穩(wěn)定。

生物相容性也是納米熒光探針在生物應(yīng)用中的一個(gè)重要考慮因素。許多課題組已經(jīng)對Pdots的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果都表明Pdots具有非常低的細(xì)胞毒性。例如Christensen等［62］對尺寸約為18 nm的疏水性Pdots的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究。他們在J774.A1細(xì)胞孵育的過程中加入了不同濃度的PFBT Pdots和Cell Titer Blue(追蹤細(xì)胞增殖活性的染料)。在細(xì)胞孵育18 h后，觀察到實(shí)驗(yàn)組中加入不同濃度的Pdots的細(xì)胞的存活率與對照組中沒加Pdots的細(xì)胞的存活率相差很小;內(nèi)吞了Pdots的細(xì)胞沒有損傷和裂解、形態(tài)正常，說明Pdots對細(xì)胞的增殖和活性沒有明顯的影響。

3 半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用

3.1 細(xì)胞標(biāo)記

具有小尺寸、高亮度、快速的輻射躍遷速率、良好的光穩(wěn)定性以及無毒等優(yōu)點(diǎn)的Pdots非常適合生物應(yīng)用。體外細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，基于細(xì)胞的內(nèi)吞作用可以實(shí)現(xiàn)Pdots對細(xì)胞的非特異性標(biāo)記［54］。Pdots和 Texas Red dextran的細(xì)胞內(nèi)熒光共定位方法證明了細(xì)胞可以通過胞飲作用來攝取Pdots［62］。在特定波長激發(fā)下，共聚焦顯微鏡可以檢測到細(xì)胞內(nèi)攝取的Pdots發(fā)出的強(qiáng)烈的熒光。由于Pdots具備高熒光亮度的特性，因此可以使用較低濃度的Pdots標(biāo)記細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中最低能檢測到155 pmol/L(270 ppb)的 Pdots，而且免疫熒光共定位的方法已經(jīng)證實(shí)Pdots進(jìn)入細(xì)胞后最終會到達(dá)溶酶體［62］。

在細(xì)胞特異性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，Pdots與生物分子進(jìn)行共價(jià)連接，通過抗原-抗體或者生物素-鏈霉親合素系統(tǒng)的相互作用再與細(xì)胞中的受體分子結(jié)合以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的特異性標(biāo)記。免疫球蛋白G(IgG)和鏈霉親和素(Streptavidin)廣泛用于細(xì)胞靶向的免疫熒光標(biāo)記。Chiu課題組［45］將表面功能化的Pdots分別與IgG和Streptavidin進(jìn)行共價(jià)連接，制備了兩種粒徑為10～20 nm的Pdot-IgG和Pdot-streptavidin生物熒光探針并檢測了它們對細(xì)胞特異性標(biāo)記的能力。上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)是一種腫瘤標(biāo)志物，常用來檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞。由圖5(a)可知，將人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)與anti-EpCAM抗體共同孵育一段時(shí)間后，使用Pdot-IgG標(biāo)記可以檢測到MCF-7細(xì)胞表面發(fā)出Pdots的熒光，說明Pdot-IgG探針成功地標(biāo)記了MCF-7細(xì)胞。由圖5(b)可知，使用Pdot-IgG標(biāo)記未與anti-EpCAM抗體共同孵育的MCF-7細(xì)胞，共聚焦顯微鏡下沒有檢測到細(xì)胞表面發(fā)出Pdots的熒光。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Pdot-IgG探針可以對細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效率的特異性標(biāo)記。此外，使用Pdot-streptavidin探針重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)也可以得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用流式細(xì)胞分析儀檢測特異性標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)記物，處理流式細(xì)胞數(shù)據(jù)得到圖5(c)和圖5(d)。圖5(c)是 Pdot-streptavidin標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布，圖5(d)是使用Qdot565與Streptavidin制備的Qdot-streptavidin探針在相同實(shí)驗(yàn)條件下標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布。分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)可知，在標(biāo)記細(xì)胞亮度方面，Pdot-streptavidin比Qdot-streptavidin的亮度高出約25倍，這個(gè)結(jié)果表明Pdots在細(xì)胞成像和生物測定等方面具有很大的應(yīng)用潛力。

圖5 (a)Pdot-IgG標(biāo)記與一級EpCAM單克隆抗體共同孵育一段時(shí)間后的MCF-7細(xì)胞的熒光圖片;(b)Pdot-IgG標(biāo)記未與一級EpCAM單克隆抗體共同孵育的MCF-7細(xì)胞的熒光圖片;(c)Pdot-streptavidin標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布;(d)與Pdot-streptavidin標(biāo)記細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相同條件下的Qdot-streptavidin標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布。Fig.5 (a)Fluorescence image of the cell-surfacemarker EpCAM on MCF-7 cells incubated sequentially with anti-EpCAM primary antibody and Pdot-IgG conjugates.(b)Fluorescence image of the control sample in which the cellswere incubated with Pdot-IgG alone(no primary EpCAM antibody).(c)Fluorescence intensity distributions for Pdot-streptavidin labeled MCF-7 cells.(d)Fluorescence intensity distributions for Qdot-streptavidin labeled MCF-7 cells obtained under identical experimental conditions as those used in(c).

在生物研究中，疊氮和炔基等基團(tuán)不受生物體內(nèi)各種反應(yīng)的干擾和生物分子的影響，可以在復(fù)雜的生物體內(nèi)和細(xì)胞環(huán)境中發(fā)生生物正交反應(yīng)。表面帶有羧基的Pdots與含胺的小分子(如終端帶胺的聚乙二醇、炔胺分子、疊氮胺分子)連接可以獲得表面帶疊氮或炔基的Pdots，從而進(jìn)行生物正交標(biāo)記實(shí)驗(yàn)［44］。圖6是Pdots的表面修飾和生物正交反應(yīng)示意圖。實(shí)驗(yàn)中使用含羧基的聚合物PSMA對Pdots進(jìn)行表面修飾后，用一種碳二亞胺鹽酸鹽EDC催化表面功能化的Pdots與含胺的小分子之間的反應(yīng)。隨后的實(shí)驗(yàn)中使用Cu(Ⅰ)離子催化含疊氮基團(tuán)的Pdots與終端含炔的蛋白質(zhì)分子之間的生物正交反應(yīng)。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Chiu課題組［44］使用人工氨基酸(如 AHA或HPG)標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中可以觀測到這種被標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過生物正交反應(yīng)與偶聯(lián)了炔基的Pdots結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)高特異性的細(xì)胞靶向標(biāo)記。

圖6 Pdots的表面修飾和生物正交反應(yīng)示意圖Fig.6 Pdot functionalization and subsequent bioorthogonal labeling via click chemistry

3.2 體內(nèi)成像

在光與生物體之間的相互作用中，散射、吸收和生物組織自體熒光等現(xiàn)象會嚴(yán)重干擾在體成像的熒光信號，所以生物體內(nèi)熒光成像目前主要用于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并沒有廣泛地應(yīng)用于臨床研究中。在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中使用亮度比傳統(tǒng)有機(jī)染料高幾個(gè)數(shù)量級的近紅外熒光探針可以達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)效果。Pdots具有極強(qiáng)的吸光能力和高度靈敏的熒光信號，因此水溶性的Pdots在生物成像應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢［26，33］。Kim 研究組［63］已經(jīng)成功地將半導(dǎo)體聚合物納米粒子應(yīng)用于小鼠前哨淋巴結(jié)的體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)。

熒光探針的大小、表面性能和生物體的血腦屏障等因素都會影響活體成像技術(shù)在腦腫瘤組織研究中的實(shí)驗(yàn)效果，因此腦腫瘤活體成像實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的研究［64］。為此，Chiu課題組［65］開發(fā)了對深層組織滲透能力較強(qiáng)的尺寸約為10～20 nm的高亮度近紅外熒光Pdots，并選擇了對腫瘤親和性很強(qiáng)的蝎氯毒素Chlorotoxin(CTX)作為腫瘤靶向配體，最終得到了與腫瘤肽配體結(jié)合的生物熒光探針。由于ND2:SmoA1型小鼠的腦腫瘤與人類的髓母細(xì)胞瘤病理相似，因此ND2:SmoA1型小鼠是很好的研究模型。他們對ND2:SmoA1轉(zhuǎn)基因型(患病)和野生型(健康)兩種小鼠靜脈注射 Pdot-CTX和 Pdot-PEG(無CTX的對照組)兩種生物熒光探針。如圖7所示，對于注射Pdot-CTX的兩種類型的小鼠，24 h后可以觀測到野生型小鼠腦部無明顯的熒光，ND2:SmoA1型小鼠腦部長有腫瘤的區(qū)域發(fā)出Pdot-CTX的強(qiáng)烈的熒光信號。而注射Pdot-PEG的兩種類型的小鼠腦部區(qū)域均沒有明顯的熒光信號。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靶向熒光探針Pdot-CTX會與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合并在腦部腫瘤區(qū)域累積。繼續(xù)觀察注射Pdot-CTX的兩種類型的小鼠，在靜脈注射72 h后，已觀測不到小鼠血液中有明顯的Pdot-CTX的熒光信號。對小鼠實(shí)行安樂死后取其腎臟、脾臟和肝臟，對各種器官內(nèi)的熒光強(qiáng)度分布結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示無論是野生型還是ND2:SmoA1型小鼠，腎臟內(nèi)幾乎無熒光分布的，脾臟內(nèi)的熒光信號強(qiáng)度較低，肝臟內(nèi)熒光信號則很強(qiáng)，說明肝臟對Pdot-CTX探針有明顯的攝取，這暗示了小鼠體內(nèi)的Pdot-CTX納米熒光探針可能是經(jīng)由肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁進(jìn)而隨糞便排出體外［66］。該研究表明基于Pdots的熒光探針在體內(nèi)癌癥臨床診斷和治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。

圖7 健康的野生型小鼠腦的熒光成像(左)和患有髓母細(xì)胞瘤的ND2:SmoA1小鼠腦的熒光成像(右)照片。分別經(jīng)尾靜脈注射50μL濃度為1μmol/L非特異性的Pdot-PEG(上部)探針和特異性的Pdot-CTX(中部)探針的小鼠腦的熒光成像照片，對照組:沒有接受注射的小鼠腦的熒光成像照片(底部)。Fig.7 Fluorescence imaging of healthy brains in wild-type mice(left)and medulloblastoma tumors in ND2:SmoA1 mice(right).Each mouse was injected through the tail vein with 50μL of 1μmol/L solution of either non-targeting Pdot-PEG(top)，or targeting Pdot-CTX(middle).As a control，somemice did not receive injection(bottom).

3.3 生物傳感和單粒子示蹤

圖8 (a)摻雜PtOEP的PDHF納米顆粒的發(fā)射光譜，插圖是在氮?dú)怙柡汀⒖諝夂脱鯕怙柡蜅l件下紫外光照射得到的Pdots水溶液的照片;(b)Pdots的單粒子熒光示蹤照片。明場下一個(gè)固定的細(xì)胞的透射照片，藍(lán)色對應(yīng)與膜結(jié)合的Pdots粒子，綠色對應(yīng)細(xì)胞外的Pdots粒子，紅色對應(yīng)細(xì)胞內(nèi)部的Pdots粒子。Fig.8 (a)Emission spectra of the10%PtOEP-doped PDHF dots.The insetshows doped PDHF dots in aqueous solutions saturated with nitrogen，air and oxygen，respectively，under a UV lamp.(b)Single-particle fluorescence tracking with Pdots.Bright-field transmission image of a fixed cell.Blue corresponds to a particle bound to themembrane，green corresponds to a particle outside the cell，and red corresponds to the cell interior.

McNeill研究組［67］開發(fā)了具有內(nèi)參比功能的熒光生物氧傳感器，在摻雜了對氧敏感的磷光染料分子PtOEP(Platinum(Ⅱ)octaethylporphine)的Pdots中，可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而檢測生物體中的氧濃度。圖8(a)是摻雜PtOEP的PDHF納米顆粒的發(fā)射光譜。在不同氧濃度下，在420 nm處的聚合物PDHF的發(fā)射峰幾乎不變，而在650 nm處的PtOEP的發(fā)射峰值則隨著氧氣濃度的減少而增大。圖8(a)插圖為在365 nm紫外燈照射下的照片:在氮?dú)怙柡蜅l件下，Pdots水溶液發(fā)射強(qiáng)烈的熒光;在空氣氣氛下，Pdots水溶液發(fā)射較弱的熒光;在氧氣飽和條件下，由于氧氣猝滅導(dǎo)致Pdots水溶液發(fā)射出微弱的熒光。近期，本課題組利用Tb3+與表面帶有羧基的Pdots反應(yīng)形成螯合物，然后在螯合物溶液中加入一定濃度的細(xì)菌芽孢標(biāo)記物CaDPA(Calcium dipicolinate)，最后得到了具有內(nèi)參比功能的熒光傳感器，能夠檢測水溶液中的細(xì)菌芽孢［68］。

納米尺度的二維和三維的單粒子示蹤技術(shù)在細(xì)胞生命活動(dòng)(馬達(dá)蛋白的運(yùn)動(dòng)、分子運(yùn)輸、生物膜動(dòng)力學(xué)等)的研究中有很多的應(yīng)用［3，5］。McNeill等［69-70］研究了Pdots在納米尺度的二維和三維的粒子示蹤技術(shù)中的應(yīng)用。他們使用倒置熒光顯微鏡CCD成像系統(tǒng)對單個(gè)納米顆粒進(jìn)行圖像采集，分析了20個(gè)典型的單個(gè)納米顆粒的熒光強(qiáng)度軌跡，結(jié)果表明:單個(gè)聚合物納米顆粒發(fā)射的光子數(shù)平均約為109個(gè)，甚至可以超過1010個(gè)。這種檢測方法理論上可以達(dá)到1 nm的分辨率。圖8(b)是Pdots的單粒子熒光示蹤照片，Pdots可以與細(xì)胞的某些組分發(fā)生可逆或不可逆的結(jié)合，從而進(jìn)行粒子追蹤，表明Pdots在檢測細(xì)胞中某些生物分子和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的遷移活動(dòng)等研究中具有應(yīng)用潛力。

3.4 藥物傳輸和光動(dòng)力學(xué)療法

納米醫(yī)藥技術(shù)可以將藥物或者其他活性物質(zhì)特異性地輸送到病患組織［71］。疏水的Pdots可作為輸送載體，利用載體的屏蔽作用可以保護(hù)藥物。藥物被包覆在Pdots內(nèi)部或者與Pdots共價(jià)連接，在生物體內(nèi)被輸送到患病組織處再被釋放出來［72］。目前納米醫(yī)藥的研究熱點(diǎn)之一是如何開發(fā)合適的Pdots使之用于藥物和基因傳遞。Wang等［73］將偶聯(lián)了抗癌藥物阿霉素(Doxorubicin)的聚谷氨酸包覆在聚合物PFO的內(nèi)部，當(dāng)?shù)竭_(dá)病灶部位時(shí)，釋放出的阿霉素會猝滅PFO的熒光，所以可以通過監(jiān)測PFO的熒光強(qiáng)度的變化來判斷釋放的藥物濃度的情況。

光動(dòng)力學(xué)療法(Photodynamic therapy，PDT)是一種新型的癌癥臨床治療方法。在PDT當(dāng)中，光敏劑可以和生物組織中的氧分子反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(ROS)，如對生物組織有毒的單線態(tài)氧(1O2)和氧自由基，從而殺死癌細(xì)胞。PDT可以在有限的區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生療效，并不會損壞病灶周圍的健康組織和細(xì)胞，所以在癌癥治療的臨床研究中已經(jīng)成為一種重要的方法［74］。熒光共軛聚合物量子點(diǎn)自身可以作為光敏劑與生物體中的氧作用生成1O2。Wang等［75］制備了一種水溶性的含有卟啉的聚噻吩。在黑暗條件下，這種聚噻吩-卟啉復(fù)合聚合物對細(xì)胞沒有毒性;在光激發(fā)條件下，能量從聚噻吩骨架轉(zhuǎn)移到卟啉單元，從而誘導(dǎo)氧分子產(chǎn)生1O2，進(jìn)而有效地殺死鄰近的癌細(xì)胞。

4 結(jié) 論

半導(dǎo)體聚合物納米粒子具有尺寸小、亮度高、輻射躍遷速率快、光穩(wěn)定性和生物相容性好等優(yōu)異特性。這種熒光探針在許多重要的領(lǐng)域，如熒光成像、生物傳感、藥物傳輸以及疾病診斷和治療等領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。進(jìn)一步優(yōu)化半導(dǎo)體聚合物納米粒子的光學(xué)性能和表面特性，探索開發(fā)多功能的納米熒光探針可為今后的多模態(tài)醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷和治療等領(lǐng)域的研究提供有意義的指導(dǎo)和幫助。

［1］Pepperkok R，Ellenberg J.High-throughput fluorescencemicroscopy for systems biology［J］.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2006，7(9):690-696.

［2］Mason W T.Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity:A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-time Analysis［M］.2nd ed.London:Academic Press，1999.

［3］Yildiz A，F(xiàn)orkey JN，Selvin PR，etal.Myosin V walks hand-over-hand:Single fluorophore imagingwith 1.5-nm localization ［J］.Science，2003，300(5628):2061-2065.

［4］Xie X S，Yu J，Yang W Y.Living cells as test tubes［J］.Science，2006，312(5771):228-230.

［5］MoernerW.New directions in single-molecule imaging and analysis［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.，2007，104(31):12596-12602.

［6］Betzig E，Patterson GH，Hess H F，etal.Imaging intracellular fluorescent proteins atnanometer resolution［J］.Science，2006，313(5793):1642-1645.

［7］Hell SW.Far-field optical nanoscopy［J］.Science，2007，316(5828):1153-1158.

［8］Chan W C W，Nie S M.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection［J］.Science，1998，281(5385):2016-2018.

［9］Tuncel D，Demir H V.Conjugated polymer nanoparticles［J］.Nanoscale，2010，2(4):484-494.

［10］He Y，Zhong Y L，Peng F，etal.One-potmicrowave synthesis ofwater-dispersible，ultraphoto-and pH-stable，and highly fluorescent silicon quantum dots［J］.J.Am.Chem.Soc.，2011，133(36):14192-14195.

［11］Sun Y P，Zhou B，Wang H F，et al.Quantum-sized carbon dots for bright and colorful photoluminescence［J］.J.Am.Chem.Soc.，2006，128(24):7756-7757.

［12］Baker SN，Baker G A.Luminescent carbon nanodots:Emergent nanolights［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2010，49(38):6726-6744.

［13］Ow H，Larson D R，Wiesner U，et al.Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles［J］.Nano Lett.，2005，5(1):113-117.

［14］Bruchez M，Moronne M，Alivisatos A P，et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels［J］.Science，1998，281(5385):2013-2016.

［15］Michalet X，Pinaud F F，Weiss S，et al.Quantum dots for live cells，in vivoimaging，and diagnostics［J］.Science，2005，307(5709):538-544.

［16］Burroughes JH，Jones C A，F(xiàn)riend R H.New semiconductor device physics in polymer diodes and transistors［J］.Nature，1988，335(6186):137-141.

［17］Piok T，Gamerith S，Scherf U，et al.Organic light-emitting devices fabricated from semiconducting nanospheres［J］.Adv.Mater.，2003，15(10):800-804.

［18］Pu K Y，Liu B.Fluorescent conjugated polyelectrolytes for bioimaging ［J］.Adv.Funct.Mater.，2011，21(18):3408-3423.

［19］Pecher J，Mecking S.Nanoparticles of conjugated polymers［J］.Chem.Rev.，2010，110(10):6260-6279.

［20］Kaeser A，Schenning A PH J.Fluorescent nanoparticles based on self-assembled π-conjugated systems［J］.Adv.Mater.，2010，22(28):2985-2997.

［21］Cordovilla C，Swager TM.Strain release in organic photonic nanoparticles for protease sensing［J］.J.Am.Chem.Soc.，2012，134(16):6932-6935.

［22］Harbron E J，Davis CM，Economou N J，etal.Photochromic dye-doped conjugated polymer nanoparticles:Photomodulated emission and nanoenvironmental characterization［J］.J.Phys.Chem.C，2009，113(31):13707-13714.

［23］Rahim N A A，McDaniel W，Moon JH，et al.Conjugated polymer nanoparticles for two-photon imaging of endothelial cells in a tissuemodel［J］.Adv.Mater.，2009，21(34):3492-3496.

［24］Park S J，Kang SG，Park S J，et al.Highly tunable photoluminescent properties of amphiphilic conjugated block copolymers［J］.J.Am.Chem.Soc.，2010，132(29):9931-9933.

［25］Abbel R，Van der Weegen R，Meijer EW，et al.Multicolour self-assembled particles of fluorene-based bolaamphiphiles［J］.Chem.Commun.，2009，13:1697-1699.

［26］Wu C F，Chiu D T.Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2013，52(11):3086-3109.

［27］Szymanski C，Wu C F，McNeill J，et al.Singlemolecule nanoparticles of the conjugated polymer MEH-PPV，preparation and characterization by near-field scanning opticalmicroscopy［J］.J.Phys.Chem.B，2005，109(18):8543-8546.

［28］Tian Z Y，Yu JB，McNeill J，et al.Amplified energy transfer in conjugated polymer nanoparticle tags and sensors［J］.Nanoscale，2010，2(10):1999-2011.

［29］Wu C F，Peng H S，McNeill J，et al.Energy transfermediated fluorescence from blended conjugated polymer nanoparticles［J］.J.Phys.Chem.B，2006，110(29):14148-14154.

［30］Wu C F，Zheng Y L，McNeill J，et al.Energy transfer in a nanoscalemultichromophoric system:Fluorescent dye-doped conjugated polymer nanoparticles［J］.J.Phys.Chem.C，2008，112(6):1772-1781.

［31］Jin Y H，Ye FM，Chiu D T，et al.Near-infrared fluorescent dye-doped semiconducting polymer dots［J］.ACSNano，2011，5(2):1468-1475.

［32］Chan Y H，Wu C F，Chiu D T，et al.Development of ultrabright semiconducting polymer dots for ratiometric pH sensing［J］.Anal.Chem.，2011，83(4):1448-1455.

［33］Ye FM，Wu C F，Chiu D T，et al.A compact and highly fluorescent orange-emitting polymer dot for specific subcellular imaging［J］.Chem.Commun.，2012，48(12):1778-1780.

［34］Hide F，Diaz-Garcia M A，Heeger A J，etal.New developments in the photonic applications of conjugated polymers［J］.Acc.Chem.Res.，1997，30(10):430-436.

［35］Baier M C，Huber J，Mecking S.Fluorescent conjugated polymer nanoparticles by polymerization inminiemulsion［J］.J.Am.Chem.Soc.，2009，131(40):14267-14273.

［36］Pecher J，Huber J，Mecking S，et al.Tailor-made conjugated polymer nanoparticles formulticolor and multiphoton cell imaging［J］.Biomacromol.，2010，11(10):2776-2780.

［37］Hittinger E，Kokil A，Weder C.Synthesis and characterization of cross-linked conjugated polymer milli-，micro-，and nanoparticles［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43(14):1808-1811.

［38］Landfester K，Montenegro R，Kietzke T，et al.Semiconducting polymer nanospheres in aqueous dispersion prepared by a miniemulsion process［J］.Adv.Mater.，2002，14(9):651-655.

［39］Kietzke T，Neher D，Scherf U，etal.Novel approaches to polymer blends based on polymer nanoparticles［J］.Nat.Mater.，2003，2(6):408-412.

［40］Kurokawa N，Yoshikawa H，Masuhara H，et al.Size-dependent spectroscopic properties and thermochromic behavior in poly(substituted thiophene)nanoparticles［J］.ChemPhysChem，2004，5(10):1609-1615.

［41］Howes P，Green M，Hughes M，etal.Phospholipid encapsulated semiconducting polymer nanoparticles:Their use in cell imaging and protein attachment［J］.J.Am.Chem.Soc.，2010，132(11):3989-3996.

［42］Li K，Pan J，Liu B，etal.Generic strategy of preparing fluorescent conjugated-polymer-loaded poly(DL-lactide-co-glycolide)nanoparticles for targeted cell imaging［J］.Adv.Funct.Mater.，2009，19(22):3535-3542.

［43］Wu C F，Szymanski C，McNeill J.Preparation and encapsulation of highly fluorescent conjugated polymer nanoparticles［J］.Langmuir，2006，22(7):2956-2960.

［44］Wu C F，Jin Y H，Chiu D T，etal.Ultrabrightand bioorthogonal labeling of cellular targets using semiconducting polymer dots and click chemistry［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2010，49(49):9436-9440.

［45］Wu C F，Schneider T，Chiu D T，etal.Bioconjugation ofultrabright semiconducting polymer dots for specific cellular targeting［J］.J.Am.Chem.Soc.，2010，132(43):15410-15417.

［46］Zhang X J，Yu JB，Chiu D T，et al.Importance of having low-density functional groups for generating high-performance semiconducting polymer dots［J］.ACSNano，2012，6(6):5429-5439.

［47］Yu JB，Wu C F，Chiu D T，etal.Stable functionalization of small semiconducting polymer dotsviacovalent cross-linking and their application for specific cellular imaging［J］.Adv.Mater.，2012，24(26):3498-3504.

［48］LiQ，Zhang JN，Wu C F，etal.Europium-complex-grafted polymer dots for amplified quenching and cellular imaging applications［J］.Langmuir，2014，30(28):8607-8614.

［49］Liu W H，Howarth M，BawendiM G，et al.Compact biocompatible quantum dots functionalized for cellular imaging［J］.J.Am.Chem.Soc.，2008，130(4):1274-1284.

［50］Howarth M，Liu W H，Ting A Y，etal.Monovalent，reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells［J］.Nat.Methods，2008，5(5):397-399.

［51］Chandler D.Interfaces and the driving force of hydrophobic assembly［J］.Nature，2005，437(7059):640-647.

［52］Ten Wolde PR，Chandler D.Drying-induced hydrophobic polymer collapse［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99(10):6539-6543.

［53］Sun K，Chen H B，Wu C F，et al.Size-dependent property and cell labeling of semiconducting polymer dots［J］.ACS Appl.Mater.Interf.，2014，6(13):10802-10812.

［54］Wu C F，Bull B，McNeill J，et al.Multicolor conjugated polymer dots for biological fluorescence imaging［J］.ACS Nano，2008，2(11):2415-2423.

［55］Nguyen TQ，Martini IB，Liu J，et al.Controlling interchain interactions in conjugated polymers:The effects of chain morphology on exciton-exciton annihilation and aggregation in MEH-PPV films［J］.J.Phys.Chem.B，2000，104(2):237-255.

［56］Dahan M，Laurence T，Weiss S，et al.Time-gated biological imaging by use of colloidal quantum dots［J］.Opt.Lett.，2001，26(11):825-827.

［57］Eggeling C，Widengren J，Seidel C A M，etal.Photobleaching of fluorescent dyes under conditions used for single-molecule detection:Evidence of two-step photolysis［J］.Anal.Chem.，1998，70(13):2651-2659.

［58］Wu C F，Szymanski C，McNeill J，et al.Conjugated polymer dots for multiphoton fluorescence imaging［J］.J.Am.Chem.Soc.，2007，129(43):12904-12905.

［59］Grey JK，Kim D Y，Barbara P F，et al.Size-dependent spectroscopic properties of conjugated polymer nanoparticles［J］.J.Phys.Chem.B，2006，110(51):25568-25572.

［60］Van Sark W G JH M，F(xiàn)rederix P L T M，Meijerink A，et al.Photooxidation and photobleaching of single CdSe/ZnS quantum dots probed by room-temperature time-resolved spectroscopy ［J］.J.Phys.Chem.B，2001，105(35):8281-8284.

［61］Jin Y H，Ye FM，Chiu D T，etal.Generation of functionalized and robust semiconducting polymer dotswith polyelectrolytes［J］.Chem.Commun.，2012，48(26):3161-3163.

［62］Fernando L P，Kandel PK，Christensen K A，etal.Mechanism of cellular uptake of highly fluorescent conjugated polymer nanoparticles［J］.Biomacromol.，2010，11(10):2675-2682.

［63］Kim S，Na J，Kwon IC，et al.Conjugated polymer nanoparticles for biomedicalin vivoimaging［J］.Chem.Commun.，2010，46(10):1617-1619.

［64］Veiseh O，Sun C，F(xiàn)ang Chen，et al.Specific targeting of brain tumors with an optical/magnetic resonance imaging nanoprobe across the blood-brain barrier［J］.Cancer Res.，2009，69(15):6200-6207.

［65］Wu C F，Hansen S J，Chiu D T，et al.Design of highly emissive polymer dot bioconjugates forin vivotumor targeting［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2011，50(15):3430-3434.

［66］Choi H S，Liu W H，F(xiàn)rangioni JV，et al.Renal clearance of quantum dots［J］.Nat.Biotechnol.，2007，25(10):1165-1170.

［67］Wu C F，Bull B，McNeill J，et al.Ratiometric single-nanoparticle oxygen sensors for biological imaging［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2009，48(15):2741-2745.

［68］Li Q，Sun K，Wu C F，et al.Ratiometric luminescent detection of bacterial spores with terbium chelated semiconducting polymer dots［J］.Anal.Chem.，2013，85(19):9087-9091.

［69］Yu JB，Wu C F，McNeill J，et al.Nanoscale 3D tracking with conjugated polymer nanoparticles［J］.J.Am.Chem.Soc.，2009，131(51):18410-18414.

［70］Yu JB，Wu C F，McNeill J，et al.Tracking of single charge carriers in a conjugated polymer nanoparticle［J］.Nano Lett.，2012，12(3):1300-1306.

［71］Sinha R，Kim G J，Shin DM，etal.Nanotechnology in cancer therapeutics:Bioconjugated nanoparticles for drug delivery［J］.Mol.Cancer Ther.，2006，5(8):1909-1917.

［72］Nie SM，Xing Y，Simons JW，etal.Nanotechnology applications in cancer［J］.Annu.Rev.Biomed.Eng.，2007，9:257-288.

［73］Feng X L，Lv F T，Wang S，et al.Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging［J］.ACSAppl.Mater.Interf.，2010，2(8):2429-2435.

［74］Agostinis P，Berg K，Kessel D，et al.Photodynamic therapy of cancer:An update［J］.CA-Cancer J.Clin.，2011，61(4):250-281.

［75］Xing C F，Wang S，Bazan G C，et al.Design guidelines for conjugated polymers with light-activated anticancer activity［J］.Adv.Funct.Mater.，2011，21(21):4058-4067.

張佳楠(1990-)，女，吉林長春人，碩士研究生，2013年于吉林大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事納米生物熒光探針的研究。

E-mail:jianan13@mails.jlu.edu.cn

吳長鋒(1976-)，男，山東德州人，教授，博士生導(dǎo)師，2004年于長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所獲得博士學(xué)位，2011年入選國家首批青年千人計(jì)劃，主要從事生物光子學(xué)、分子探針及成像技術(shù)、光電功能高分子材料、生物分析檢測與生物傳感器等方面的研究。

E-mail:cwu@jlu.edu.cn