夏婷婷，周 麗，陳興勇，匡厚坤，耿照玉

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036;2.安徽太陽禽業(yè)有限公司，安徽寧國 242300）

14個微衛(wèi)星標(biāo)記分析巢湖麻鴨群體的遺傳多樣性

夏婷婷1，周 麗1，陳興勇1，匡厚坤2，耿照玉1

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036;2.安徽太陽禽業(yè)有限公司，安徽寧國 242300）

利用14個微衛(wèi)星標(biāo)記分析安徽省地方品種巢湖麻鴨群體的遺傳多樣性.結(jié)果表明，14個微衛(wèi)星標(biāo)記在巢湖麻鴨群體中共檢測出48個等位基因，每個基因座平均等位基因數(shù)為3.43個，各個基因的基因頻率分布在0.0265－0.9735之間，14個微衛(wèi)星座位的多態(tài)信息含量在0.1866－0.9471之間，有效等位基因數(shù)為2－6個，基因遺傳雜合度變化范圍為0.0516－0.8054.群體遺傳結(jié)構(gòu)顯示巢湖麻鴨核心群存在一定的遺傳多樣性，可用于巢湖麻鴨的定向選育.

巢湖麻鴨;微衛(wèi)星標(biāo)記;群體遺傳多樣性

我國擁有地方鴨品種27個，是世界上鴨品種最多的國家.地方鴨品種的遺傳多樣性十分豐富，是未來品種改良和適應(yīng)性生產(chǎn)條件變化的遺傳基礎(chǔ)和原始素材［1］.巢湖麻鴨屬肉蛋兼用的中型麻鴨品種，原產(chǎn)于安徽省中部，巢湖周圍的廬江縣、無為縣和居巢區(qū)等地，是巢湖地區(qū)勞動人民經(jīng)過長期人工選育和自然馴化而形成的優(yōu)良地方品種.巢湖麻鴨的抗逆性強和肉質(zhì)優(yōu)良等特點成為其保種的重要原因.因此，研究巢湖麻鴨群體遺傳結(jié)構(gòu)可為其保種及定向選育或遺傳改良提供重要依據(jù).

微衛(wèi)星是分析廣泛分布于生物體整個基因組，具有保守性、共顯性遺傳和DNA多態(tài)性雜合程度高的特點［2］.利用微衛(wèi)星標(biāo)記進行畜禽品種的分子標(biāo)記研究已有大量報道.Chakrabory et al［3］認為，微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性能夠充分反應(yīng)出物種的進化歷史;龔道清等［4］采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記研究了高郵鴨群體遺傳多樣性;張揚等［5］采用微衛(wèi)星標(biāo)記預(yù)測了家鴨與番鴨雜交F1代部分生長階段的肉用雜種優(yōu)勢，為解釋雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生提供了分子生物學(xué)依據(jù).鑒于此，本試驗利用14對遺傳多樣性較為豐富的微衛(wèi)星引物分析了巢湖麻鴨群體的遺傳多樣性，旨在為巢湖麻鴨遺傳資源的保存以及進一步開發(fā)利用提供重要的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 試驗選用16周齡巢湖麻鴨96只，飼養(yǎng)于安徽省太陽禽業(yè)有限公司.翅靜脈采血約2 mL于EDTA抗凝管中，公母各半，置－20℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 微衛(wèi)星引物 試驗用14對引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見表1.

表1 微衛(wèi)星引物序列及其退火溫度Table 1 Microsatellite primer sequences and annealing temperature

1.1.3 試劑與儀器 Premix TapTM、DNA Marker和6×DNA Loading Buffer為大連寶生物工程公司產(chǎn)品，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N，N，N，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）和EDTA購自北京索萊寶科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.主要儀器有PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）和凝膠成像儀（江蘇捷達科技公司）.

1.2 血液基因組提取

血液DNA按TIAN amp Blood DNA Kit試劑盒步驟進行，血樣處理、裂解和漂洗等步驟得到的血樣DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后置－20℃保存?zhèn)溆?

1.3 PCR擴增反應(yīng)

PCR體系共20μL，含10μL Premix、上下游引物各1μL、7μL ddH2O和1μL模版.反應(yīng)條件:95℃變性4 min;95℃變性30 s，55－60℃（具體溫度見表1）退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán);72℃延伸10 min.于4℃保存.

1.4 電泳

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，銀染法顯色，膠片觀察燈下觀察電泳結(jié)果，拍照，裝袋，保存.

1.5 數(shù)據(jù)處理

由于微衛(wèi)星標(biāo)記呈共顯性遺傳，通過其表現(xiàn)型可直接反映基因型.因此根據(jù)電泳結(jié)果可以直接判斷出每一個體的基因型，經(jīng)過簡單計算可以得出各群體在各微衛(wèi)星標(biāo)記位點上的等位基因頻率.

2 結(jié)果與分析

2.1 血液DNA的檢測結(jié)果

提取的DNA樣品檢測結(jié)果（圖1）顯示，純度和亮度都比較高，無拖尾現(xiàn)象，可以滿足試驗要求.

圖1 基因組DNA電泳檢測圖Fig.1 Electrophoresis of genome DNA

2.2 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性檢測結(jié)果

部分微衛(wèi)星引物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖如圖2所示.14個微衛(wèi)星標(biāo)記在巢湖麻鴨群體中共檢測出48個等位基因，平均等位基因數(shù)為3.43個.其中，APL02引物共檢測出6個等位基因，CAUD080和APH10引物僅檢測出2個等位基因，其他11對引物檢測出的等位基因數(shù)為3或4個.等位基因頻率分布在0.0265 －0.9735之間（表2）.

圖2 CAUD011和CAUD037引物PCR產(chǎn)物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 PCR products amplified by primer CAUD011 and CAUD037 on non － denatured PAGE gel

表2 14個微衛(wèi)星座位的等位基因頻率分布Table 2 Alleles frequency distribution of fourteen microsatellites

2.3 遺傳雜合度和多態(tài)信息含量

巢湖麻鴨14個微衛(wèi)星座位的基因遺傳雜合度和多態(tài)信息含量（表3）顯示，基因遺傳雜合度變化范圍為0.0516 －0.8054.CAUD080 的多態(tài)信息含量最高，達到0.9471，APL02 最低，為 0.1866，其余12 個微衛(wèi)星座位的多態(tài)信息含量分布在0.2522－0.7921范圍內(nèi).

表3 14個微衛(wèi)星座位的基因遺傳雜合度和多態(tài)信息含量Table 3 Polymorphism information content and heterozygosisty of fourteen microsatellites in Chaohu duck

3 討論

微衛(wèi)星是由2或3個核苷酸重復(fù)序列所構(gòu)成的核心部分和兩端的側(cè)翼序列組成，側(cè)翼序列使微衛(wèi)星基因座位具有特異性，而微衛(wèi)星本身重復(fù)單位數(shù)的變異使其具有多態(tài)性［6－9］.家禽微衛(wèi)星標(biāo)記位點等位基因數(shù)一般為2－20個，大部分為5－7個.本試驗結(jié)果表明，巢湖麻鴨14個微衛(wèi)星座位共檢測出48個等位基因，每對微衛(wèi)星引物檢測到的等位基因數(shù)在2－6個不等，平均等位基因數(shù)3.43個.此結(jié)果與趙東偉等［10］對巢湖鴨的研究結(jié)果較一致，表明本試驗所選取的微衛(wèi)星標(biāo)記位點對該群體巢湖麻鴨品種的遺傳結(jié)構(gòu)分析具有指導(dǎo)意義.

在微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)中，基因遺傳雜合度是估測群體遺傳變異的一個重要指標(biāo).群體遺傳雜合度越低，反映該群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異就越低，群體的遺傳多樣性越差［11］.本試驗中，14個微衛(wèi)星座位標(biāo)記的基因遺傳雜合度變化范圍為0.0516－0.8054，表明供試巢湖麻鴨群體的遺傳多樣性相對較高，有利于下一步的育種中對其優(yōu)勢性狀的選育及利用.

多態(tài)信息含量是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)多態(tài)信息含量≥0.5時，該座位為高度多態(tài)性座位，0.25≤多態(tài)信息含量＜0.5時為中度多態(tài)性座位，多態(tài)信息含量＜0.25時為低度多態(tài)性座位［12］.在一個群體中，多態(tài)信息含量越大，提供的遺傳信息越多.本試驗中，14個微衛(wèi)星座位中有1個低度多態(tài)，5個中度多態(tài)，8個高度多態(tài)，為后續(xù)育種提供了一定的遺傳信息.

龔道清等［13］利用微衛(wèi)星引物CMO212對高郵鴨群體進行多態(tài)性檢測的結(jié)果表明，其遺傳雜合度達0.689，多態(tài)信息含量達0.628，均高于本試驗中該引物的分析結(jié)果.劉瑋孟等［14］利用微衛(wèi)星引物CAUD037對縉云麻鴨和紹興鴨進行遺傳距離分析的結(jié)果表明，這兩種鴨群體的多態(tài)信息含量均低于本試驗中該引物的分析結(jié)果.因此，同一對微衛(wèi)星引物在不同鴨群體中檢測出的基因遺傳雜合度和多態(tài)信息含量各不相同.

在畜禽品種資源的利用與保存過程中，定期對群體進行分子遺傳評估是十分必要的，而微衛(wèi)星標(biāo)記在動物育種中有著廣泛的應(yīng)用，尤其是在遺傳多樣性評估方面的應(yīng)用.巢湖麻鴨在安徽皖中地帶久負盛名，在今后對巢湖麻鴨的利用和選育方面需要加大對群體的遺傳評估，本試驗所選取的8個具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星座位標(biāo)記值得進一步研究，估計在今后巢湖麻鴨的分子遺傳選育方面能得到應(yīng)用.

［1］齊景發(fā)，賈幼陵，何新天，等.中國畜禽遺傳資源狀況［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004:16.

［2］張于光，李迪強，肖啟明，等.微衛(wèi)星技術(shù)及在動物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001，27（5）:410 －414.

［3］CHAKRABORY R，ZHONG Y，ANDRADE DE M，et al.Linkage disequilibria among（CA）npolymorphism in the human dystrophin gene and their implications in carrier detection and prenatal diagnosis in duchenne and beckermuscular dystrophies［J］.Genomics，1994，21:567 －570.

［4］龔道清，張紅，張軍，等.高郵鴨微衛(wèi)星DNA標(biāo)記遺傳多樣性的研究［J］.中國家禽，2005，27（21）:9－11.

［5］張揚，李秀，趙榮雪，等.利用微衛(wèi)星DNA多態(tài)性預(yù)測半番鴨的雜種優(yōu)勢［J］.中國畜牧雜志，2011，47（17）:1－5.

［6］KAYANG BB，INOUE-MURAYAMAM，HOSHIT，etal，Microsatellite loci in Japanese quailand cross-species amplification in chicken and Guinea fowl［J］.Genetics Selection Evolution，2002，34（2）:233 －253.

［7］王昕，耿社民，朱育紅.微衛(wèi)星標(biāo)記在畜禽育種中的應(yīng)用［J］.黃牛雜志，2002，28（1）:39－42.

［8］顧志良，王志躍，張軍.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記及其在雞的基因圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用［J］.中國家禽，1997，19（6）:27－29.

［9］LIU Z，CROOIJMANSR，VANDERPOELM，et al.Use of chickenmicrosatellitemarkers in turkey:a pessimistic view［J］.Animal Genetics，1996，27（3）:191 －193.

［10］趙東偉，湯青萍，李慧芳，等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析巢湖鴨群體的遺傳多樣性［J］.石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，28（4）:427－431.

［11］趙旭庭，段修軍，楊廷桂，等.11個鴨種（群）遺傳變異的微衛(wèi)星標(biāo)記分析［J］.揚州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2005，26（4）:34－38.

［12］BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkagemap in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.American Journal of Human Genetics，1980，32（3）:314 －331.

［13］龔道清，張紅，張軍，等.運用微衛(wèi)星標(biāo)記分析11個鴨種（群）的親緣關(guān)系［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36（12）:1256－1260.

［14］劉瑋孟，張靜，盧立志，等.縉云麻鴨與紹興鴨各品系的遺傳距離分析［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2011，32（2）:8－12.

（責(zé)任編輯:施曉棠）

Population genetic diversity analysis of Chaohu duck using fourteen m icrosatellitemarkers

XIA Ting-ting1，ZHOU Li1，CHEN Xing-yong1，KUANG Hou-kun2，GENG Zhao-yü1
（1.College of Animal Science and Techology，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui230036，China;
2.Anhui Taiyang Poultry Co.Ltd.，Ningguo，Anhui242300，China）

The population genetic diversity was analyzed in Chaohu duck，a Chinese indigenous breed，using fourteenmicrosatellite markers.The results showed that48 alleleswere detected from the 96 Chaohu duck in which the average allele number per lociwas 3.43.The genetic gene frequency distribution was between 0.0265 and 0.9735.The polymorphism information of the fourteenmicrosatellite seats contentwas between 0.1866 and 0.9471.The effective number of alleles was between 2 to 6，and the genetic heterozygosity ranged between 0.0516 and 0.8054.Population genetic structure showed that the genetic diversity distributed in the selected Chaohu duck can be considered for evaluation of further selection.

Chaohu duck;microsatellite;population genetic diversity

S834

A

1671-5470（2015）03-0293-05

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.013

2014－04－16

2014－05－09

國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-43-31）;安徽省畜禽產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究院資助項目.

夏婷婷（1990－），女，博士研究生.研究方向:家禽遺傳育種.Email:928893932@qq.com.通訊作者耿照玉（1963－），男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向:家禽遺傳育種與生產(chǎn).Email:gzy@ahau.edu.cn.