高明燕，胡茂志，沈欣悅，周 生，徐 步

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州225125;2.揚(yáng)州大學(xué)

江蘇省物質(zhì)微區(qū)與性能測(cè)試服務(wù)中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

禽多殺性巴氏桿菌C48-1株OmpA基因表達(dá)與抗原性鑒定

高明燕1，胡茂志2，沈欣悅1，周 生1，徐 步1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州225125;2.揚(yáng)州大學(xué)

江蘇省物質(zhì)微區(qū)與性能測(cè)試服務(wù)中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

為了研究禽多殺性巴氏桿菌（Pm）外膜蛋白A（OmpA）的免疫原性，根據(jù)C48-1菌株OmpA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用PCR方法擴(kuò)增去信號(hào)肽的成熟OmpA基因.將去信號(hào)肽的成熟OmpA基因擴(kuò)增片段雙酶切后，克隆到pGEX-6p-1表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-OmpA，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21并經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE的結(jié)果顯示，融合蛋白GST-OmpA大小約為63 ku，與預(yù)期的分子質(zhì)量相符.免疫印跡分析結(jié)果表明，該融合蛋白與雞抗Pm血清具有明顯的免疫反應(yīng)，說明OmpA具有良好的抗原性，這為禽Pm OmpA在免疫防御研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

禽多殺性巴氏桿菌;外膜蛋白A;原核表達(dá);免疫印跡

禽霍亂，又稱禽巴氏桿菌病、禽出血性敗血癥，是一種侵害家禽和野禽的急性、敗血性傳染病，是養(yǎng)禽業(yè)中重要的細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］.多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是禽霍亂的病原菌，主要以莢膜抗原和菌體抗原區(qū)分血清型，莢膜抗原分為A、B、D、E、F等5個(gè)血清型;菌體抗原分為16（1－16）個(gè)血清型［2］.禽Pm的血清型主要為A:1、A:3、A:5，我國分離到的菌株血清型以 A:1 為主［2－3］.

外膜蛋白A（outermembrane protein A，OmpA）是普遍存在于革蘭氏陰性菌表面的蛋白，具有維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、保證物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ埽⒃诩?xì)菌對(duì)宿主的感染、致病和免疫中都起著重要的作用［4］.目前，關(guān)于革蘭氏陰性菌，諸如大腸桿菌、克雷伯氏菌等的OmpA在免疫調(diào)節(jié)等方面功能的研究與發(fā)現(xiàn)較多［5－6］，而Pm OmpA的免疫作用以及免疫功能等相關(guān)研究還非常少.已知Pm OmpA具有免疫原性，能夠在小鼠模型上誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但在家禽體內(nèi)的免疫功能和作用還缺乏了解［4］.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)禽Pm標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株C48-1與其他多個(gè)國內(nèi)禽分離株的OmpA基因序列的同源性高達(dá)100%;進(jìn)一步證實(shí)禽Pm OmpA基因序列非常保守［7］.因此為進(jìn)一步深入研究OmpA的功能，本試驗(yàn)選擇C48-1菌株，以其OmpA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，進(jìn)行原核表達(dá)和抗原性分析，旨在為禽Pm OmpA的免疫與致病功能研究提供生物材料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒 C48-1菌株源自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;大腸桿菌DH5α、BL21以及原核表達(dá)載體pGEX-6p-1由本課題組保存，pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司.

1.1.2 試劑 EX-Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）、X-Gal均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品;DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA Marker、SOC肉湯、LB肉湯、LB瓊脂、氨芐青霉素鈉（Amp）等購自生工生物工程（上海）有限公司;預(yù)染蛋白Marker購于Fermentas公司;酶標(biāo)羊抗雞IgG為Bethyl公司產(chǎn)品;免疫印跡相關(guān)試劑均為北京康為世紀(jì)生物有限公司產(chǎn)品;雞抗Pm陽性血清由本課題組制備.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考前期測(cè)定的C48-1菌株OmpA基因的核苷酸序列，針對(duì)成熟蛋白（去掉信號(hào)肽）基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并在上下游引物分別加入BamHⅠ、SalⅠ的酶切位點(diǎn)（下劃線），由生工生物工程（上海）有限公司合成.

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的制備 將Pm菌株C48-1接種在BHI液體培養(yǎng)基中，于37℃、100 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h，按照DNA抽提試劑盒的說明書提取細(xì)菌DNA.

1.2.3OmpA基因的擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系50μL，含25μLPremix Ex Taq混合物、1μLDNA模板、上下游引物各2μL、20μL ddH2O.PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min.采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切去信號(hào)肽OmpA基因擴(kuò)增產(chǎn)物和pGEX-6p-1質(zhì)粒，膠回收兩個(gè)片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21.挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-OmpA送金斯瑞生物有限公司測(cè)序.鑒定正確的重組菌命名為BL21（pGEX-OmpA）.

1.2.5 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌BL21（pGEX-OmpA）振蕩培養(yǎng)4 h，菌液的D600nm為0.4－0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol·L－1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h.將誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，同時(shí)用只含有空載體的重組菌BL21（pGEX-6P-1）作為陰性對(duì)照.

1.2.6 免疫印跡分析 誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)移后的NC膜在5%的脫脂乳中于4℃封閉過夜，用PBST洗膜3次，每次5 min;加入1∶500倍稀釋的雞抗Pm陽性血清孵育1 h后，棄去一抗，用PBST洗膜3次，每次5 min;再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgG（1∶1000）孵育1 h，然后棄去二抗，用PBST洗膜3次，每次5 min;最后用DAB顯色液顯色.

2 結(jié)果與分析

2.1 OmpA基因的擴(kuò)增與克隆

用所設(shè)計(jì)合成的特異性引物擴(kuò)增C48-1菌株DNA，擴(kuò)增片段大小為1000 bp，與預(yù)期結(jié)果一致.隨機(jī)挑選白色菌落的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，可見2600和1000 bp的條帶（圖1），與理論結(jié)果一致.測(cè)序證實(shí)，成熟OmpA基因長度為999 bp，序列正確.

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

提取重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-OmpA，經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定得到4900和1000 bp兩個(gè)片段.經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列與方向正確（圖2）.

圖1 Pm菌株成熟OmpA基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of Pm strainsmature OmpA gene

圖2 重組質(zhì)粒pMD18T-OmpA和pGEX-OmpA的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pMD18T-OmpA and pGEX-OmpA

2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

IPTG誘導(dǎo)的重組菌BL21（pGEX-OmpA）的裂解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，在63 ku處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致;未誘導(dǎo)的細(xì)菌未出現(xiàn)明顯的蛋白條帶;而空載體細(xì)菌BL21（pGEX-6P-1）裂解物在26 ku處出現(xiàn)明顯的GST條帶（圖3）.免疫印跡結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白能夠與雞抗Pm陽性血清呈免疫反應(yīng)，而空載體對(duì)照與陽性血清沒有反應(yīng)條帶，由此推定表達(dá)的蛋白與細(xì)菌菌體的OmpA具有相似的抗原性（圖4）.

圖3 重組菌的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of recombinant bacteria

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析結(jié)果Fig.4 Western blotting analysis of expressing product

3 討論

Gatto et al［8］研究顯示，Pm提純的OmpA具有很強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的抗體;Dabo et al［9］報(bào)道，原核表達(dá)的OmpA能夠引起小鼠強(qiáng)烈的Th2類免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IgG1抗體;Lu et al［10］制備的OmpA單克隆抗體被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)果表明，攻毒后接種動(dòng)物死亡率下降.本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)原核表達(dá)的Pm OmpA能夠與Pm雞抗血清產(chǎn)生免疫反應(yīng)，說明原核表達(dá)的OmpA與細(xì)菌本身的OmpA具有相似的抗原位點(diǎn)，能夠利用其進(jìn)行免疫和致病等相關(guān)功能的研究.

OmpA屬跨膜蛋白，其全基因表達(dá)產(chǎn)物（也稱前蛋白）由于帶有信號(hào)肽，能夠引導(dǎo)前蛋白整合到大腸桿菌外膜中，從而引起大腸桿菌外膜失去原有的完整性和穩(wěn)定性，導(dǎo)致大腸桿菌死亡引起表達(dá)失敗.因此，本試驗(yàn)選擇去掉信號(hào)肽的成熟OmpA進(jìn)行表達(dá)的方案，因?qū)Υ竽c桿菌不產(chǎn)生干擾作用從而獲得了成功表達(dá).

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pGEX-OmpA重組表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)了OmpA-GST融合蛋白;免疫印跡分析結(jié)果表明，該融合蛋白具有良好的免疫原性，為進(jìn)一步研究OmpA在疾病防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

［1］SAIF Y M.禽病學(xué)［M］.12 版.蘇敬良，高福，索勛，譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

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（責(zé)任編輯:施曉棠）

Prokaryotic expression and antigenicity analysis of the OmpA gene of avian Pasteurella multocida strain C48-1

GAO Ming-yan1，HU Mao-zhi2，SHEN Xin-yue1，ZHOU Sheng1，XU Bu1
（1.Poultry Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Yangzhou，Jiangsu 225125，China;2.Jiangsu Test and Service Center for Material Microanalysis and Property，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

According to the nucleotide sequencing resultof outermembrane protein A（OmpA）gene ofPasteurellamultocida（Pm）C48-1 strain，a pair of primers were designed.ThematureOmpAgene of C48-1 strain was amplified by polymerase chain reaction technique and then cloned into prokaryote expression vector pGEX-6p-1 for sequence analysis.The recombinant plasmid，pGEXOmpA was then transformed intoE.coliBL21.After induction with Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside（IPTG），SDS-PAGE and western blotting results showed that the fusion protein GST-OmpA was about63 ku and could be detected by chick serum against Pm.So，itwas suggested that the OmpA protein was a immunodominance antigen in the process of Pm infection and could be used in the study of immune protection against Pm.

avianpasteurellamultocida;outermembrane protein A;prokaryotic expression;Western blotting

S852.61

A

1671-5470（2015）03-0289-04

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.012

2014－01－13

2014－10－11

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303044）;江蘇省家禽科學(xué)研究所青年科學(xué)基金項(xiàng)目（JQ201102）.

高明燕（1978－），女，助理研究員，碩士.研究方向:禽病防治.Email:gmy_stella@sina.com.通訊作者徐步（1964－），男，研究員，碩士.研究方向:禽病防治.Email:bu_xu@yahoo.com.cn.