廖琳琳，章淑玲，肖 順，張紹升

（福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350002）

寄生于花生的根腐線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定及致病性測(cè)定

廖琳琳，章淑玲，肖 順，張紹升

（福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350002）

在福建省福清市漁溪鎮(zhèn)花生根部發(fā)現(xiàn)根腐線蟲(chóng)的侵害，通過(guò)形態(tài)特征觀察和rDNA-ITS區(qū)測(cè)序及序列比對(duì)，將其鑒定為咖啡根腐線蟲(chóng).盆栽接種試驗(yàn)證明，該線蟲(chóng)可以侵染花生的根系和莢果，影響植株生長(zhǎng)并降低結(jié)莢率，對(duì)花生具有顯著的致病性.

咖啡根腐線蟲(chóng);花生;致病性

花生（Arachis hypogaeaL.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物.花生生長(zhǎng)過(guò)程中易遭受許多病原菌的侵害，其中線蟲(chóng)病的危害極其嚴(yán)重.我國(guó)已報(bào)道寄生于花生的線蟲(chóng)達(dá)到13屬22種［1－4］，在我國(guó)北方花生產(chǎn)區(qū)花生根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生嚴(yán)重［5－7］.近幾年，我國(guó)發(fā)現(xiàn)花生莖線蟲(chóng)病，其病原被鑒定為腐爛莖線蟲(chóng)（Ditylenchus destructor）［8－9］，2013 年報(bào)道了花生莖線蟲(chóng)（Ditylenchusarachis）［10］.最近，在福建省的花生根部和果莢上發(fā)現(xiàn)根腐線蟲(chóng)（Pratylenchussp.），但有關(guān)根腐線蟲(chóng)對(duì)花生的危害性在我國(guó)尚無(wú)報(bào)道.因此，本文對(duì)花生根腐線蟲(chóng)病的癥狀進(jìn)行觀察描述，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定線蟲(chóng)種類(lèi)，并通過(guò)盆栽接種試驗(yàn)測(cè)定該線蟲(chóng)對(duì)花生的致病性.

1 材料與方法

1.1 樣本采集和癥狀觀察

線蟲(chóng)樣本采自福建省福清市漁溪鎮(zhèn)花生的根、莢果和根際土壤.

癥狀觀察以田間癥狀和接種癥狀相結(jié)合，肉眼觀察病株地上部的生長(zhǎng)情況、根部被害狀、果莢形狀和病變組織特征，以及果莢內(nèi)壁組織和種皮病變狀況.病根、病莢和種皮內(nèi)的線蟲(chóng)采用組織染色法進(jìn)行觀察［11］.

1.2 線蟲(chóng)的分離

取田間長(zhǎng)勢(shì)衰弱的花生植株的根系、莢果和根際土壤，采用貝曼漏斗法［1］分離線蟲(chóng).另外，病根、病莢和種皮內(nèi)的線蟲(chóng)采用直接解剖分離.

1.3 線蟲(chóng)的純化和培養(yǎng)

收集從病莢中分離的線蟲(chóng)，在體視顯微鏡下挑取形態(tài)一致的根腐線蟲(chóng)成熟雌蟲(chóng)于凹玻片的滅菌水中，經(jīng)光學(xué)顯微鏡檢查確定該線蟲(chóng)的形態(tài).將經(jīng)過(guò)檢查確認(rèn)的線蟲(chóng)作為培養(yǎng)繁殖的接種體，移入0.2%氯霉素溶液中消毒15 min，用無(wú)菌水清洗3次后，轉(zhuǎn)移至胡蘿卜愈傷組織上，每塊愈傷組織中接種30條成熟雌蟲(chóng).接種線蟲(chóng)后的胡蘿卜愈傷組織于28℃黑暗培養(yǎng)60 d，繁殖出大量的線蟲(chóng).

將培養(yǎng)繁殖線蟲(chóng)的胡蘿卜愈傷組織移入小燒杯中搗碎并用無(wú)菌水?dāng)嚢杞?，用過(guò)篩法篩取線蟲(chóng)，用于形態(tài)鑒定、分子生物學(xué)鑒定以及致病性測(cè)定.

胡蘿卜愈傷組織的制備方法參照文獻(xiàn)［1］.選擇健康無(wú)損傷的胡蘿卜，用自來(lái)水洗凈并晾干.在超凈工作臺(tái)上將清潔的胡蘿卜用75%酒精浸泡數(shù)秒后，點(diǎn)燃燒干殘留于其表面的酒精，用滅菌刀片削去胡蘿卜表皮，選取中間段切成7 mm厚的薄片.將薄片移入滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿放置一片，用保鮮膜密封后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待愈傷組織形成后即可使用.

1.4 線蟲(chóng)標(biāo)本制作與保存

將純化培養(yǎng)得到的線蟲(chóng)置于體視顯微鏡下，挑取雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)于凹玻片的水滴中，經(jīng)酒精燈火焰溫?zé)釟⑺?將殺死后的線蟲(chóng)挑到滴有TAF固定液的載玻片上制成臨時(shí)玻片，用于形態(tài)特征觀察.取部分線蟲(chóng)樣本經(jīng)脫水后制成永久玻片用于保存［1］.

1.5 線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 利用光學(xué)顯微鏡觀察線蟲(chóng)雌、雄蟲(chóng)的形態(tài)特征并測(cè)量.形態(tài)計(jì)測(cè)采用De Man公式［1］:DGO=背食道腺開(kāi)口至口針基部球的距離，EP=排泄孔至頭端距離，VA=陰門(mén)至肛門(mén)的距離，VBW=陰門(mén)處體寬，PUS=后陰子宮囊長(zhǎng)，a=體長(zhǎng)/最大體寬，b=體長(zhǎng)/頭端至食道與腸連接處的距離，b'=體長(zhǎng)/頭端至食道末端的距離，c=體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)，c'=尾長(zhǎng)/肛門(mén)處體寬，V=陰門(mén)至頭頂距離×100/體長(zhǎng)，T=泄殖腔至精巢最前端距離×100/體長(zhǎng).

1.5.2 分子鑒定 （1）DNA提取.從純化培養(yǎng)分離得到的線蟲(chóng)中挑取單條雌蟲(chóng)，置于滅菌的ddH2O中清洗 3 次.取 20 μLWLB 裂解液 （50 mmol·L－1KCl、10 mmol·L－1Tris pH 8.3、2.5mmol·L－1MgCl2、0.45%NP 40、0.45%Tween 20，pH=8.3）于200 μL 的PCR 管中，并加1 μL 蛋白酶K 溶液（1.2 mg·mL－1）混勻.挑取經(jīng)清洗的線蟲(chóng)于混合液中，用挑針壓斷線蟲(chóng)，將其置于－20℃冰箱中過(guò)夜.然后放入PCR儀中65℃溫育1 h，95℃ 10 min，降溫至4℃后，將其作為模板加入反應(yīng)體系中擴(kuò)增.ITS區(qū)擴(kuò)增:引物為通用引物TW81（5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3'）和AB28（5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'）.采用50μL反應(yīng)體系，包括25 μL PCR Master Mixture、5 μL DNA 模板、2 μL上游引物（10 mmol·L－1）、2 μL下游引物（10 mmol·L－1）、16 μL ddH2O.擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性 150 s;95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸10 min，于12℃保存［12］.

（2）電泳檢測(cè).反應(yīng)結(jié)束后，將1%瓊脂糖凝膠置于0.5×TBE的電泳緩沖液中.取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL 6×loadingbuffer和0.2μL核酸染料混合，將其加入凝膠孔中，在電壓100 V、電流40 mA的條件下電泳30 min.電泳結(jié)束后，用全自動(dòng)凝膠成像儀觀察、拍照.

（3）PCR產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序分析.PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化、克隆和測(cè)序.將測(cè)序結(jié)果拼接后在NCBI上進(jìn)行相似性比對(duì)，并在GenBank上登錄以獲得相應(yīng)登錄號(hào).從基因庫(kù)中下載相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)使用貝葉斯法［13］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.6 致病性測(cè)定

將土壤（稻田土∶河沙=1∶1）置于烘箱中攤為10 cm厚的土層，經(jīng)過(guò)170℃滅菌3 h，待冷卻2 d后，分裝于塑料花盆內(nèi)（直徑25 cm）.將花生種子在冷水中浸泡24 h，保濕發(fā)芽后播植于花盆內(nèi)的滅菌土壤中.出苗10 d后，選留長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯花生苗進(jìn)行移栽.移栽土為相同的滅菌土，每盆1株，共栽種6盆.設(shè)3盆作為對(duì)照（不接種線蟲(chóng)），另外3盆接種含有各齡根腐線蟲(chóng)的懸浮液（500條左右）于植株根部.莢果成熟期（約100 d）檢查線蟲(chóng)侵染情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲(chóng)田間為害癥狀與致病性測(cè)定

在田間受根腐線蟲(chóng)侵害的花生植株長(zhǎng)勢(shì)矮小、衰弱（圖1A）.結(jié)莢數(shù)減少60%以上，果莢表面形成黑色侵染傷斑;根瘤形成少或無(wú)根瘤;根系變黑，表皮腐爛（圖1B）.在體視顯微鏡下解剖病組織可以觀察到大量根腐線蟲(chóng)，同時(shí)對(duì)病組織染色可以看到入侵的線蟲(chóng)（圖1C）.

與未接種植株相比，接種植株地上部表現(xiàn)為黃化、矮小和生長(zhǎng)不良（圖1D）;接種的花生植株根系變黑、腐爛，莢果少且不飽滿（圖1E）.對(duì)病根和病莢組織染色可發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)寄生于其中（圖1F）.

圖1 根腐線蟲(chóng)危害花生的癥狀及接種試驗(yàn)Fig.1 Symptoms of peanut infected by root-lesion nematodes and inoculation test

2.2 病原線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表1.

表1 福建花生根腐線蟲(chóng)與文獻(xiàn)記述的咖啡根腐線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量值比較Table 1 Morphometrics of root-lesion nematode from Fujian peanut and Pratylenchus coffeae from the previous records

雌蟲(chóng):蟲(chóng)體經(jīng)緩慢加熱殺死后，體僵直或稍向腹面彎曲（圖2A）.唇區(qū)低平，有2個(gè)唇環(huán).口針粗短、發(fā)達(dá)，基部球圓形;背食道腺開(kāi)口距口針基部球2－3μm（圖2C）.體環(huán)明顯，側(cè)區(qū)具4條側(cè)線，約占體寬的1/3（圖2E）.中食道球發(fā)達(dá)、卵圓形，食道腺?gòu)母姑婧蛡?cè)面覆蓋腸的前端，覆蓋長(zhǎng)度為體寬的1.2－2.3倍.排泄孔位于食道—腸瓣門(mén)的前方，半月體緊靠排泄孔的前部，約2個(gè)體環(huán)的寬度（圖2F）.單卵巢前伸，后陰子宮囊長(zhǎng)度為體寬的1.0－1.5倍.陰肛距約為尾長(zhǎng)的2.7倍.尾部近圓柱形，末端寬圓（圖2G）、平截（圖2H）或斜截（圖2I），光滑，無(wú)環(huán)紋;側(cè)尾腺口較小，位于尾的中后部;尾腹環(huán)17－20個(gè).

雄蟲(chóng):前體部形態(tài)特征與雌蟲(chóng)基本相似（圖2B、D）.交合刺纖細(xì)、成對(duì)，長(zhǎng)約21μm，引帶長(zhǎng)5μm，交合傘包至尾端，尾較尖（圖2J）.

圖2 寄生于花生的根腐線蟲(chóng)形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of root-lesion nematodes parasiting on peanut

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)根腐線蟲(chóng)的rDNA-ITS區(qū)測(cè)序后獲得長(zhǎng)度為1037 bp的序列.將該序列在GenBank上登錄，登錄號(hào)為KF534516.同時(shí)，BLAST比對(duì)分析表明，該線蟲(chóng)的rDNA-ITS序列與Pratylenchus coffeae序列的相似性最高，達(dá)到93% －99%.

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）來(lái)看，該線蟲(chóng)與P.coffeae種群同源性最高，以100%的置信度歸為一大支，且遺傳距離小;與其他根腐線蟲(chóng)“種”同源性較低，分列于不同枝;與不同屬的相似穿孔線蟲(chóng)同源性最低.

2.2.3 分類(lèi)地位 根據(jù)線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)測(cè)定結(jié)果，并與參考文獻(xiàn)［14－15］的描述比對(duì)可知，采自福建省漁溪鎮(zhèn)花生的根腐線蟲(chóng)為咖啡根腐線蟲(chóng)［Pratylenchus coffeae（Zimmermann）Filipjev＆Schuurmans Stekhoven］，隸屬墊刃目（Tylenchida）墊刃總科（Tylenchoidea）根腐科（Pratylenchidae）根腐線蟲(chóng)屬（Pratylenchus）.

3 結(jié)論

在福建省福清市的花生根部發(fā)現(xiàn)根腐線蟲(chóng)侵染.通過(guò)線蟲(chóng)的形態(tài)特征觀察和rDNA-ITS區(qū)測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比對(duì)，將該線蟲(chóng)鑒定為咖啡根腐線蟲(chóng).經(jīng)胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)繁殖，并接種于花生植株，證明其對(duì)花生具有致病能力.田間調(diào)查和接種試驗(yàn)證明咖啡根腐線蟲(chóng)為害花生根系和莢果，造成根系腐爛，嚴(yán)重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì).福建省是我國(guó)花生的主產(chǎn)區(qū)之一，咖啡根腐線蟲(chóng)對(duì)花生的危害需引起有關(guān)部門(mén)的重視，及時(shí)采取相應(yīng)的防控措施.

圖3 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequence

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（責(zé)任編輯:楊郁霞）

Identification and pathogenicity of root-lesion nematodes parasiting on the peanut

LIAO Lin-lin，ZHANG Shu-ling，XIAO Shun，ZHANG Shao-sheng
（College of Plant Protection，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Root-lesion nematodeswere discovered from the root of peanut in Yuxi，F(xiàn)uqing，F(xiàn)ujian Province.According to themorphological and rDNA-ITS characteristics，the nematodes were identified asPratylenchus coffeae.Inoculation test showed that the nematodes could infect the pods and root of peanut，limite the growth of peanut and reduce the number of pods.It really indicated thatP.coffeaecould cause the disease seriously.

Pratylenchus coffeae;peanut;pathogenicity

S432.4

A

1671-5470（2015）03-0240-05

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.004

2014－04－16

2014－05－12

國(guó)家自然科學(xué)基金—青年科學(xué)基金（31201495）.

廖琳琳（1989－），女，碩士研究生.研究方向:植物檢疫和植物線蟲(chóng)學(xué).Email:liaolinlin100@126.com.通訊作者張紹升（1951－），男，教授.研究方向:植物線蟲(chóng)學(xué).Email:shaoshengzhang@126.com.