林月緒，張 華，陳如凱

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，福建福州 350002）

HPLC-RID測(cè)定甘蔗莖節(jié)蔗糖、葡萄糖和果糖含量

林月緒1，張 華2，陳如凱2

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，福建福州 350002）

研究高效液相色譜示差折光檢測(cè)法（HPLC-RID）測(cè)定甘蔗莖節(jié)3種主要糖分蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，摒棄有毒流動(dòng)相乙腈，建立一種無(wú)毒、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法.該法通過(guò)乙醇浸提，采用Waters SugarPakⅠ色譜柱（6.5 mm×300 mm，10 μm），流動(dòng)相為超純水，流速0.4 mL·min-1，柱溫90℃，檢測(cè)器溫度35℃.檢測(cè)方法線性關(guān)系好、靈敏度高，RSD為2.77%-4.5%（n=5），方法重復(fù)性良好;加標(biāo)回收率高，達(dá)95.4%-101.8%;能滿足甘蔗及相似作物中3種糖的準(zhǔn)確分析.

HPLC-RID;甘蔗莖節(jié);蔗糖;葡萄糖;果糖

甘蔗是我國(guó)最重要的糖料作物之一，甘蔗莖節(jié)含有蔗糖、葡萄糖、果糖等糖類，甘蔗糖類檢測(cè)對(duì)甘蔗品質(zhì)鑒定、品種開(kāi)發(fā)和種植有重要意義［1，2］.目前，蔗糖、葡萄糖、果糖的檢測(cè)方法有氣相色譜法［3，4］、離子色譜法［5，6］及高效液相色譜法等.氣相色譜法由于糖為非揮發(fā)性物質(zhì)需要進(jìn)行衍生化處理、檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜;離子色譜法因糖易在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)而影響檢測(cè)靈敏度、重現(xiàn)性;高效液相色譜檢測(cè)主要用碳水化合物柱、氨基柱為分離色譜柱，以乙腈和水混合溶劑為流動(dòng)相，用示差折光檢測(cè)器（RID）［1，7，8］、質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）［9，10］、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）［11-13］.乙腈是一種有毒致癌物質(zhì)，易揮發(fā)，以乙腈為流動(dòng)相不僅給測(cè)試人員身體帶來(lái)傷害，還對(duì)環(huán)境造成污染;氨基柱固定相上的氨基易與還原糖（葡萄糖、果糖）發(fā)生反應(yīng)，影響柱子壽命;質(zhì)譜、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器價(jià)格昂貴、專用性強(qiáng)，不利于檢測(cè)方法推廣普及.本研究擬建立一種安全無(wú)毒、快捷準(zhǔn)確檢測(cè)甘蔗莖節(jié)糖類含量的高效液相色譜法，該法用Waters SugarPakⅠ（鈣基糖分離柱）為HPLC色譜柱，以超純水為流動(dòng)相，適當(dāng)流速、柱溫下用示差折光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)蔗糖、葡萄糖、果糖的分離檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 甘蔗莖節(jié)樣品

甘蔗莖節(jié)樣品取自福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗研究所甘蔗種植園區(qū)，選取新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22）蔗株中部莖節(jié)，取樣時(shí)間為2014年1月6日.

1.2 儀器試劑

蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)樣為國(guó)產(chǎn)色譜純（純度≥99.5%）;Milli-Q Academic超純水機(jī);Waters2695高效液相色譜儀（具有120位自動(dòng)進(jìn)樣器）配Waters2414示差折光檢測(cè)，色譜工作站為Empower;Mettler Toledo XS205 分析天平（0.01 mg）.

1.3 色譜條件

Waters SugarPakⅠ柱（6.5 mm×300 mm，10μm），帶配套預(yù)保護(hù)柱;流動(dòng)相為超純水;柱溫90℃;流速為 0.4 mL·min-1;進(jìn)樣量 10 uL.

1.4 糖品標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取蔗糖1.0 g（準(zhǔn)確至0.01 mg）用10mL容量瓶溶解定容，制得100 g·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋得 50、40、30、20、10 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;葡萄糖、果糖各0.1 g（準(zhǔn)確至0.01 mg），分別用10 mL 容量瓶溶解定容制得 10 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋得 1.2、0.9、0.6、0.3、0.1 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;為考察標(biāo)樣分離情況，另準(zhǔn)確稱取3種糖各0.25 g于同一50mL容量瓶溶解定容制得5 g·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.所有樣品進(jìn)樣前經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾.

1.5 甘蔗莖節(jié)樣品處理方法

甘蔗等作物中糖類提取常采用乙醇水溶液水浴浸提［1，8，14］.簡(jiǎn)述如下:甘蔗莖節(jié)樣品去皮切碎于液氮中研磨成粉，準(zhǔn)確稱取1.0 g（加標(biāo)樣品于此時(shí)加入），5 mL 80%乙醇于80℃下浸提30 min，離心取上清液，殘?jiān)俅翁崛『蠛喜⑸锨逡海≌糁两珊笥贸兯芙舛ㄈ葜? mL.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)器的選擇

蔗糖、葡萄糖、果糖這些單糖、二糖在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有紫外吸收基團(tuán)，因此不能選擇紫外分光光度檢測(cè)器檢測(cè).示差折光檢測(cè)器是根據(jù)樣品流路與參比流路之間折射率的變化以測(cè)定樣品濃度的通用檢測(cè)器，適用于糖類檢測(cè);但對(duì)溫度變化敏感，要求高于室溫5-10℃［15］.本試驗(yàn)采用示差檢測(cè)器檢測(cè)，RID檢測(cè)器溫度設(shè)定為35℃［16］，靈敏度可滿足需要.

2.2 流動(dòng)相與柱溫選擇

Waters SugarPakⅠ色譜柱由鈣基樹(shù)脂填裝而成，流動(dòng)相中允許有機(jī)相最大含量為5%，過(guò)多有機(jī)相進(jìn)入系統(tǒng)可能引起填料的膨脹而永久損壞色譜柱.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，少量有機(jī)相（小于5%乙腈、甲醇）的加入對(duì)甘蔗莖節(jié)糖類分析沒(méi)有顯著影響，并引起基線漂移（如圖1，a所示）;因此直接選擇0.45μm濾膜過(guò)濾后超純水為流動(dòng)相，使用Waters2695在線脫氣系統(tǒng)脫氣.

水在低溫時(shí)高的粘度會(huì)帶來(lái)很高的反壓，為避免損壞色譜柱，分析時(shí)至少要選擇70℃以上的柱溫.實(shí)驗(yàn)過(guò)程考察0.4 mL·min-1流速時(shí)，柱溫分別為80℃、85℃、90℃、95℃時(shí)某代表性甘蔗莖節(jié)樣品的分離效果（如圖1，b，c，d，e 所示），發(fā)現(xiàn)柱溫升高各組分峰形對(duì)稱性有所改善，蔗糖與葡萄糖分離度有所增加，并能很好地減少果糖峰形寬展;但95℃柱溫下3種糖的分離效果與90℃條件下無(wú)明顯區(qū)別，考慮到柱溫過(guò)高可能影響色譜柱壽命，本試驗(yàn)采用色譜柱柱溫為90℃.

圖1 流動(dòng)相及柱溫選擇Fig.1 HPLC chromatogram of differentmobile phase and column temperature

2.3 流動(dòng)相流速選擇

由于色譜柱工作條件要求流動(dòng)相流速低于0.6 mL·min-1，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了0.2、0.4、0.6 mL·min-1條件下3種糖的分離效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.6 mL·min-1流速條件下，3種糖混合標(biāo)樣（5 g·L-1）能較好分離且分析時(shí)間短，但柱壓力顯著升高;實(shí)際測(cè)定甘蔗莖節(jié)樣品時(shí)有雜質(zhì)與蔗糖峰不能分離，干擾在0.4 mL·min-1流速條件下能很好消除;0.2 mL·min-1流速下3種糖分離效果很好，但峰形變寬且分析時(shí)間延長(zhǎng)至25 min以上.因此，選擇0.4 mL·min-1為流動(dòng)相流速條件，該流速條件能同時(shí)滿足有效分離和快速測(cè)定的需求（如圖2所示，樣品濃度均為5 g·L-1），蔗糖、葡萄糖、果糖保留值分別為10.07、12.43和14.86 min.

2.4 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限

以上述混標(biāo)初步測(cè)定某代表性甘蔗莖節(jié)樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖含量，約為0.5、1.1、25.0 g·L-1（如圖3所示）;故分別設(shè)計(jì)1.4中所述3種糖類各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液.以標(biāo)樣峰面積y為縱坐標(biāo)、標(biāo)樣質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，由工作站Empower繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線得線性回歸方程并給出判定系數(shù);按信噪比S/N=3計(jì)算出各組分檢測(cè)限，結(jié)果表明方法線性關(guān)系良好、檢測(cè)限優(yōu)于課題組前期氨基柱分析結(jié)果［1］，能滿足甘蔗莖節(jié)樣品中糖的分析（表1）.

圖2 糖標(biāo)樣及混合標(biāo)樣的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of three saccharides standards and mixture

2.5 精密度與回收率

取某代表性甘蔗莖節(jié)樣品，按1.5中所述液氮研磨、浸提、定容等步驟平行處理5份，峰面積RSD值分別為蔗糖2.77%、葡萄糖 3.23%、果糖 4.50%;某代表性樣品加標(biāo)結(jié)果如下表2所示（n=5）.結(jié)果表明，測(cè)定方法重復(fù)性好、回收率高，實(shí)驗(yàn)中成功應(yīng)用該方法檢測(cè)基地多批次甘蔗莖節(jié)樣品.

圖3 代表性樣品譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the representing samples

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、判定系數(shù)及檢測(cè)限Table1 Linearity assays of the analyticalmethod

表2 方法加標(biāo)及回收率Table 2 Recovery assay of the analyticalmethod

3 結(jié)論

本方法HPLC以鈣基陽(yáng)離子交換柱Sugar-PakⅠ為分析柱，以RID檢測(cè)器對(duì)甘蔗莖節(jié)提取液進(jìn)行分析，對(duì)甘蔗中含量較多的3種糖實(shí)現(xiàn)有效分離和定量檢測(cè).研究表明，該方法用超純水取代常用有毒溶劑乙腈作為流動(dòng)相，簡(jiǎn)便快捷、安全，結(jié)果準(zhǔn)確可靠;檢測(cè)方法線性關(guān)系好、靈敏度高，判定系數(shù)均大于0.9995;方法重復(fù)性良好，RSD小于5%、加標(biāo)回收率高;能滿足甘蔗及相似作物或水果中3種糖的準(zhǔn)確分析.

［1］逯平杰，代容春，葉冰瑩，等.高效液相色譜法測(cè)定甘蔗節(jié)間果糖，葡萄糖和蔗糖的含量［J］.食品科學(xué)，2011，32（2）:198-200.

［2］霍漢鎮(zhèn).現(xiàn)代制糖化學(xué)與工藝學(xué)［M］.化學(xué)工業(yè)出版社，2008:1-5.

［3］周欣，王慶彪，劉錫鈞，等.氣相色譜法檢測(cè)葡萄糖、麥芽糖、果糖和蔗糖［J］.海峽藥學(xué)，2001，13（4）:48-49.

［4］張峻松，宣曉泉，唐綱嶺，等.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定煙草中葡萄糖、果糖、蔗糖的含量［J］.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2007，13（2）:17-20.

［5］崔鶴，李戈，紀(jì)雷，等.離子色譜脈沖安培法測(cè)定蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗糖［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2001，10（1）:25-26.

［6］CASEIRO A，MARR IL，CLAEYSM，et al.Determination of saccharides in atmospheric aerosol using anion-exchange highperformance liquid chromatography and pulsed-amperometric detection［J］.Journal of Chromatography A，2007，1171（1-2）:37-45.

［7］DE CORTESSáNCHEZ-MATA M，CáMARA-HURTADOM，DíEZ-MARQUéSC.Identification and quantification of soluble sugars in green beans by HPLC［J］.European Food Research and Technology，2002，214（3）:254-258.

［8］胡志群，王惠聰，胡桂兵.高效液相色譜測(cè)定荔枝果肉中的糖、酸和維生素C［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2006，22（5）:582-585.

［9］王浩，劉艷琴，楊紅梅，等.液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定無(wú)糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖［J］.分析化學(xué)，2010，38（6）:873-876.

［10］CHANDRAJU S，THEJOVATHIC，KUMAR C.Extraction，isolation and identification of sugars from banana peels（Musa Sapientum）by HPLC coupled LC/MS instrument and TLC analysis［J］.Journal of Chemical and Pharmaceutical Research，2011，3（3）:312-321.

［11］楊俊，劉江生，蔡繼寶，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定煙草中的水溶性糖［J］.分析化學(xué)，2006，33（11）:1596-1598.

［12］張媛媛，聶少平，萬(wàn)成，等.高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定單糖雙糖及低聚果糖［J］.食品科學(xué)，2009，30（18）:237-239.

［13］宋曉暉，謝凱，李艷麗，等.HPLC-ELSD法測(cè)定梨果實(shí)中不同種類可溶性糖含量［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（2）:87-91.

［14］陳思，曾磊，陳尚武，等.蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的差異表達(dá)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（4）:530-537.

［15］龔時(shí)瓊.高效液相色譜儀常用檢測(cè)器的使用與維護(hù)［J］.現(xiàn)代儀器，2009，16（1）:55-55.

［16］查圣華，王澤鳳，姜水紅，等.HPLC法測(cè)定益生元沖劑中水蘇糖含量的方法學(xué)研究［J］.食品科技，2011，36（7）:278-282.

（責(zé)任編輯:吳顯達(dá)）

HPLC-RID determ ination of sucrose，glucose and fructose in sugarcane internodes

LIN Yue-xu1，ZHANG Hua2，CHEN Ru-kai2
（1.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University;2.National Research and Development Center for Sugarcane Industry Technology，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Sucrose，glucose and fructose in sugarcane internodes were determined by high performance liquid chromatography with refractive index detector（HPLC-RID）.The chromatographic separation was achieved on an Waters Sugar Pak I column（6.5 mm ×300 mm，10μm），which was held at a constant temperature of90℃，using amobile phase composed of pure water at a flow rate of0.4 mL·min-1.RID temperature was set as 35 ℃.Average spike recoveries for 6 replicate determinations of three saccharides were found in range of 94.2%-101.5% ，with a relative standard deviation（RSD）between 2.77%and 4.5% .

HPLC-RID;sugarcane internode;sucrose;glucose;fructose

O657.7

A

1671-5470（2015）03-0232-04

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.002

2014-05-30

2014-12-17

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201003009）.

林月緒（1979-），男，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士.研究方向:無(wú)機(jī)化學(xué).Email:linyuexu@163.com.