王嬌嬌，王藹明，趙勇，武曉云

間充質(zhì)干細(xì)胞(m esenchym al stem cell，MSC)是中胚層在早期發(fā)展過程中形成的多能成體干細(xì)胞，具有不斷的自我更新能力，且在特定的培養(yǎng)條件下不僅可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等，還可跨越胚層界限分化為神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞等[1]。MSC由于來源廣泛、容易分離、能快速擴(kuò)增，且具有較低的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力，目前已成為組織工程學(xué)、再生醫(yī)學(xué)和免疫抑制治療領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞來源[2-4]。國(guó)際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)提出了鑒定人MSC的3條最低標(biāo)準(zhǔn)：①塑料黏附性；②特定的細(xì)胞表面抗原表達(dá)；③多向分化潛能[5]。

目前，臨床研究中應(yīng)用的M SC主要來源于骨髓[6-7]，但骨髓中干細(xì)胞比例極低，通過分離得到的數(shù)量極少。2009年，Jazed je等[8]首次證實(shí)外科手術(shù)廢棄的輸卵管(fallop ian tube，F(xiàn)T)組織中存在MSC。2012年Jazed je等[9]又報(bào)道將人輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞(fallopian tube m esenchym al stem cell，F(xiàn)TMSC)移植到骨損傷大鼠體內(nèi)，可增強(qiáng)其骨再生能力。2013年Indum athi等[10]再次證實(shí)了輸卵管中MSC的存在，并對(duì)FTMSC與骨髓MSC的生物學(xué)特性進(jìn)行了比較，認(rèn)為FTMSC可以取代骨髓MSC用于再生醫(yī)學(xué)，作為一種新的干細(xì)胞來源。輸卵管組織全層包括黏膜層、肌層及漿膜層，黏膜層又包括上皮和其下的纖維結(jié)締組織層，后者又稱為固有膜。輸卵管內(nèi)膜(fallopian tube m ucosa，F(xiàn)M)隨月經(jīng)周期發(fā)生周期性變化，經(jīng)歷反復(fù)損傷與再生。有研究表明MSC存在于多種人體組織黏膜中，如子宮內(nèi)膜、口腔黏膜、小腸黏膜、篩竇黏膜及嗅黏膜[11-16]，所以我們推測(cè)FM中存在豐富的干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了是否存在輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞(fallop ian tube m ucosa stem cell，F(xiàn)MSC)，同時(shí)比較FMSC與FTM SC的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型、克隆形成率、增殖能力和分化能力等生物學(xué)特性，旨在為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Ⅰ型膠原酶、明膠、胰蛋白酶、胰島素、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-m ethylxanthine，IBM X)、吲哚美辛、抗壞血酸、丙酮酸鈉、地塞米松、脯氨酸、TGF-β3購(gòu)于Sigm a公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM干粉購(gòu)于Life techno logy公司，CD13、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC、CD 14、HLA-DR、CD 29、CD 90、CD 34、CD 44、CD 45、CD 19抗體均購(gòu)于BD公司，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物(insu lin-transferrinselen ium，ITS)、結(jié)晶紫染色液、茜素紅染液、阿利新藍(lán)染色液、油紅O染液購(gòu)于廣州賽業(yè)公司。

1.2 方法

1.2.1 FM及輸卵管組織的收集 收集行輸卵管切除手術(shù)的6例患者的輸卵管組織?；颊吣挲g35～55歲，均因良性疾病需行輸卵管切除術(shù)，輸卵管切除術(shù)前至少3個(gè)月未服用激素治療，術(shù)后病理均證實(shí)病變未累及輸卵管組織。所有患者均簽署知情同意書。將患者整條左側(cè)輸卵管收集在含DMEM培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。手術(shù)中切下的整條右側(cè)輸卵管組織置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，解剖顯微鏡下或肉眼下將輸卵管縱向剖開暴露FM，用鑷子將FM剝離輸卵管組織后收集在含DMEM的無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入4℃恒溫運(yùn)輸箱，24h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 FTM SC及FMSC原代分離與傳代培養(yǎng) 從無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出FM組織，用PBS液洗去表面殘留血液，剪碎至1～2mm3組織塊，用等體積的0.25%胰蛋白酶與組織塊混勻，消化30m in，2500r/m in離心8m in，加入等體積的0.1%膠原酶Ⅰ過夜消化。2000r/m in離心8m in，收集細(xì)胞，洗滌2次；將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入5m l含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48h后移去未貼壁細(xì)胞，3～4d后更換新鮮培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，按3000個(gè)/cm2的密度進(jìn)行傳代。傳至5代后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。對(duì)輸卵管組織全層進(jìn)行消化，方法同F(xiàn)M消化。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將收獲的P1～P5代FTMSC和FMSC進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后計(jì)算每一代細(xì)胞的群倍數(shù)(popu lation doub ling，PD)，公式為：PD=(lg Nh–lg Np)/lg2。Nh表示細(xì)胞的收獲數(shù)；Np表示細(xì)胞的起始數(shù)。細(xì)胞累積群倍數(shù)(cum u lative popu lation doub lings，CPD)為這一代的PD加上前一代的PD。

1.2.4 細(xì)胞表型檢測(cè) 分別取培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的P5代FTMSC和FMMSC，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/m l；同型對(duì)照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE、IgG-APC、IgG-PerCP，檢測(cè)管分別加入鼠抗人抗體10μl，在4℃下孵育30m in，用PBS洗滌1次，1000r/m in離心5m in，用500μl的PBS重懸細(xì)胞，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成率檢測(cè) FTMSC、FMMSC以1×103個(gè)/孔密度接種于6孔板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，15d后取出，固定細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色，細(xì)胞數(shù)大于40定義為克隆團(tuán)，倒置顯微鏡下計(jì)算克隆團(tuán)數(shù)量。

1.2.6 細(xì)胞分化檢測(cè) 取P5代FTMSC和FMSC，以1×105個(gè)/孔密度接種于預(yù)鋪1%明膠的6孔板中，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了5%FBS、1μm o l/L地塞米松、50μg/m l維生素C、0.01m o l/L β-甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組為添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每3d換液，誘導(dǎo)21d后，95%乙醇固定，茜素紅染色，顯微鏡下觀察胞外鈣基質(zhì)沉積情況。

取P5代FTMSC和FMSC，以1×105/孔密度接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)更換為脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基。脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了5%FBS、10μg/m l胰島素、1μm ol/L地塞米松、0.5mm o l/L IBMX、0.1mm o l/L吲哚美辛的DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組為添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每3d換液，誘導(dǎo)21d后，10%多聚甲醛固定，飽和油紅O染液染色，顯微鏡下觀察胞內(nèi)著色脂滴。

軟骨分化：調(diào)整細(xì)胞濃度為1.6×107/m l。取5μl細(xì)胞懸液，緩慢滴加至6孔板中間部位，培養(yǎng)2h，棄掉生長(zhǎng)培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了50μg/m l抗壞血酸、50μg/m l ITS、100μg/m l丙酮酸鈉、100nm ol/L地塞米松、40μg/m l脯氨酸、10ng/m l TGF-β3的DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組為添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每3d換液，每周換液2次，誘導(dǎo)分化21d后，10%多聚甲醛固定，阿利新藍(lán)染色液染色并觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 輸卵管細(xì)胞和FM細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基12h后有少量細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈單個(gè)分散或成簇生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多呈長(zhǎng)梭形、紡錘形；此后貼壁細(xì)胞迅速增殖，體積增大，形態(tài)變得纖細(xì)、細(xì)長(zhǎng)，立體感強(qiáng)，細(xì)胞集落明顯增大、增多。培養(yǎng)至7d時(shí)，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合。經(jīng)傳代，細(xì)胞逐漸表現(xiàn)為較均一的長(zhǎng)梭形，并呈漩渦狀生長(zhǎng)，P5代FMSC較FTMSC形態(tài)更加均勻一致，排列更加致密整齊(圖1)。

圖1 兩種干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(×200)Fig.1 Morphological features of FTMSC and FMSC (×200)

2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果 計(jì)算P1～P5代FTMSC和FMSC的CPD，結(jié)果顯示P1～P5代FMSC的CPD均高于FTMSC，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01，圖2)。

2.3 細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)TMSC和FMSC均陽性表達(dá)CD 13、CD 29、CD 90、CD 105和HLA-ABC，陰性表達(dá)CD 14、CD19、CD45、CD34和HLA-DR。兩種不同來源擴(kuò)增的MSC表型無差異(圖3)。

圖2 兩種干細(xì)胞的增殖能力(n=6)Fig.2 Pro liferation capacity of FTMSC and FMSC (n=6)(1)P＜0.05, (2)P＜0.01

2.4 細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)結(jié)果 將P5代輸卵管及FM細(xì)胞以低密度(1×103個(gè)/cm2)進(jìn)行接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示，輸卵管細(xì)胞形成的克隆團(tuán)為72±3個(gè)，F(xiàn)M細(xì)胞形成的克隆團(tuán)為121±3個(gè)，F(xiàn)M細(xì)胞形成克隆團(tuán)數(shù)目多于輸卵管細(xì)胞，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.5 細(xì)胞分化能力檢測(cè)結(jié)果 成骨誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果顯示，P5代FTM SC和FMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)21d后，茜素紅染色結(jié)節(jié)呈橘紅色，邊界清晰，表明有礦化基質(zhì)沉積，提示兩種干細(xì)胞均具有相似的成骨分化能力(圖4A)；成脂誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果顯示，P5代FTMSC和FMSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)21d后，油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉積，提示兩種干細(xì)胞均具有相似的成脂分化能力(圖4B)；成軟骨誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果顯示，P5代FTMSC和FMSC經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)21d后，阿新藍(lán)染色可見細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)呈藍(lán)綠色，提示兩種干細(xì)胞均具有相似的成軟骨分化能力(圖4C)。

3 討 論

目前再生醫(yī)學(xué)研究仍然主要采用骨髓來源的MSC作為種子細(xì)胞，但越來越多的組織中發(fā)現(xiàn)存在MSC，許多學(xué)者提出嘗試采用其他來源的MSC替代骨髓MSC進(jìn)行臨床研究[17-23]。輸卵管為婦產(chǎn)科手術(shù)后常見的組織廢棄物，輸卵管組織中富含MSC，可實(shí)現(xiàn)自體移植，但輸卵管作為干細(xì)胞來源用于再生醫(yī)學(xué)尚存在一些局限性：①來源有限，臨床上切除輸卵管組織的患者畢竟是少數(shù)；②如果用于自體移植，則應(yīng)用范圍也有限，并不是所有患者都切除自體輸卵管組織。本實(shí)驗(yàn)從輸卵管內(nèi)膜層組織分離培養(yǎng)干細(xì)胞，并證明FMSC符合2006年美國(guó)國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)提出的MSC鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)了FM中存在MSC；此外，通過與FTMSC生物學(xué)特性的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)FMSC較FTMSC有更強(qiáng)的增殖能力，應(yīng)用價(jià)值較大。人體細(xì)胞治療所需的細(xì)胞數(shù)量為1×106/kg，體重50kg的成人需輸注的細(xì)胞數(shù)量為5×107個(gè)。因此，如何在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠量的細(xì)胞，為患者贏得時(shí)間，顯得特別重要，尤其對(duì)于自體移植來說，增殖能力強(qiáng)可以縮短體外培養(yǎng)的時(shí)間，細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)就能達(dá)到細(xì)胞移植的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)。FM可以通過現(xiàn)有的輸卵管鏡下獲取，對(duì)患者侵襲較小，增加了自體獲取來源，且提高了應(yīng)用范圍。

圖3 兩種干細(xì)胞的免疫表型Fig.3 Imm unopheno type of FTMSC and FMSC

圖4 兩種干細(xì)胞的體外成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)及成軟骨誘導(dǎo)分化能力(×400)Fig.4 In vitro osteogenic, adipogenic and chond rogenic d ifferen tiation capacity of FTMSC and FMSC (×400)

本實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)TMSC和FMSC細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，在P5代時(shí)，F(xiàn)MSC形態(tài)較FTMSC更加均勻一致，排列更加致密整齊，這可能是由于輸卵管內(nèi)膜層消化所獲取的MSC可排除輸卵管肌層、漿膜層的干擾，純度相對(duì)較高。細(xì)胞增殖結(jié)果也顯示與FTM SC比較FMSC增殖能力較強(qiáng)，這可能與FM隨月經(jīng)周期發(fā)生周期性變化，經(jīng)歷反復(fù)損傷與再生，再生能力強(qiáng)有關(guān)。細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果顯示，在P5代時(shí)，兩種不同來源的MSC表型無明顯差別，體外誘導(dǎo)分化提示FTMSC及FMSC都具有向骨、脂肪及軟骨方向分化的潛能。

多能干細(xì)胞移植修復(fù)生殖系統(tǒng)損傷是重建生殖功能的一種新方法[24-25]。FMSC移植可能是子宮內(nèi)膜再生及生殖功能恢復(fù)的最佳選擇，這是由于FM與子宮內(nèi)膜兩者之間具有極高的相似性，主要體現(xiàn)在以下兩點(diǎn)：①輸卵管與子宮都是由胚胎時(shí)期的副中腎管(苗勒管)分化、演變衍生而來[26]；②FM是異位妊娠最常發(fā)生的部位，由細(xì)胞因子、趨化因子及黏附因子所組成的介導(dǎo)胚泡黏附的信號(hào)通路在FM與子宮內(nèi)膜上的表達(dá)是相似的，兩種內(nèi)膜組織都具有介導(dǎo)胚泡植入發(fā)生妊娠的潛能[27]。

總之，F(xiàn)M組織取材較容易，對(duì)患者侵襲較小，來源及應(yīng)用范圍廣泛，容易實(shí)現(xiàn)自體移植，且FMSC較FTMSC有更強(qiáng)的增殖能力，所以FMSC較FTMSC有更突出的優(yōu)勢(shì)及更高的臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其對(duì)自身生殖道損傷的修復(fù)優(yōu)勢(shì)更為明顯。

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