張　環(huán)

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，甘肅　蘭州　730070）

硫代乙酸/DNA修飾金電極的電化學(xué)行為研究

張環(huán)

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，甘肅蘭州730070）

摘要：采用循環(huán)伏安法，在K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液體系中，分別對裸金電極，硫代乙酸自組裝單分子膜（Self-assembled monolayers：SAMs）修飾的金電極、二次自組裝技術(shù)制備的Au/硫醇/DNA混合雙層膜（Hybrid Bilayer Membranes，HBMs）修飾的金電極的電化學(xué)行為進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，硫代乙酸自組裝單分子膜使DNA和可能與DNA相互作用的生物物質(zhì)避免了與金電極表面的直接接觸，從而防止可能發(fā)生的變性。利用自組裝單分子膜對電極的封閉作用，可以消除由吸附產(chǎn)生的對金屬電極的毒化。

關(guān)鍵詞：自組裝單分子膜；硫代乙酸；DNA；修飾電極；循環(huán)伏安法

SAMs作為制備超薄有序膜的一種新技術(shù)，為研究表面和界面現(xiàn)象提供了分子水平上精確控制界面性質(zhì)的理想方法，從而迅速成為有關(guān)學(xué)科研究的焦點(diǎn)［1-5］。利用SAMs膜技術(shù)已成功地研制了一類優(yōu)良的化學(xué)修飾電極。該類型的SAMs包括有機(jī)硅烷在羥基化表面（SiO2/Si、Al2O3/Al、玻璃等）；醇和胺在鉑表面，硫醇、二硫化物和硫化物在金、銀、銅表面；脂肪酸在金屬氧化物表面；膦酸在金屬磷酸鹽表面及異腈在鉑表面。近年來，有關(guān)硫化物在金表面形成單分子層的報道日益增多，將硫醇自組裝到金電極表面形成的單分子層膜因具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和有序性，而受到人們越來越多的關(guān)注［6］，然而，對自組裝單分子層研究最廣泛并且最深入的是烷基硫醇類物質(zhì)在Au表面的自組裝。目前，利用自組裝單分子膜技術(shù)在分子水平上按人們預(yù)期的目標(biāo)進(jìn)行設(shè)計SAMs被廣泛研究［3，5］，而通過巰基（—SH）在Au表面自組裝制備DNA修飾電極的方法尚未見報道。筆者采用先進(jìn)的—SH化合物自組裝，得到自組裝單分子層（SAM）后，對其進(jìn)行電化學(xué)測試，再在SAM上共價鍵合或吸附固定DNA的方法制備DNA修飾電極，并對得到的DNA修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，以期為基因傳感器、DNA與其他分子的相互作用、以及DNA識別分析提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器電化學(xué)系統(tǒng)CH-Instruments work station660（美國CH公司）電極系統(tǒng)為傳統(tǒng)三電極系統(tǒng)，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，工作電極為膜修飾的金電極）。Branson 200超聲清洗儀（美國），PHS3C型酸度計（上海）。

1.1.2試劑硫代乙酸（CH3COSH，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；小牛胸腺DNA（北京華美生物工程公司生產(chǎn)）；雙蒸水；電解質(zhì)［5 mmol/L的K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液］；丙酮（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；Tris（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；無水乙醇（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)）。0.5 mol/L Tris溶液配制：先準(zhǔn)確稱取3.028 5 g Tris，用雙蒸水定容至50 mL，用pH酸度計將pH調(diào)至5，使Tris溶液濃度為0.5 mol/L。

1.2方法

1.2.1金電極的預(yù)處理封裝金電極（D=3 mm純度大于99.99%）。首先將金電極分別用0.3 μm 和0.05 μm的Al2O3仔細(xì)拋光，分別在丙酮，乙醇和二次水中超聲波清洗，每次5 min，再用N2干燥，在-0.2～0.8 V范圍內(nèi)作循環(huán)伏安掃描，檢測電極是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。支持電解質(zhì)溶液為：K3Fe（CN）6/ K4Fe（CN）6（5 mmol/L）溶液體系，要求其氧化還原峰電位差ΔEp＜75Mv。

1.2.2硫醇自組膜的制備配制5 mmol/L硫代乙酸溶液，將處理好的金電極從無水乙醇中取出并置于裝有半瓶5 mmol/L硫代乙酸溶液的青霉素瓶中，蓋好塞子，并用膠帶纏好進(jìn)行自組裝一定時間，通常不少于24 h［7］。金電極在5 mmol/L硫代乙酸/丙酮溶液中浸泡24 h，取出，用水沖洗后，即得到硫代乙酸自組裝單分子層修飾電極（SAM/Au），再依次用無水乙醇、二次蒸餾水沖洗，以除去表面物理吸附的分子，然后用高純N2吹干表面溶劑，立即進(jìn)行電化學(xué)測試。測試溶液中含有相同濃度的Fe（CN）3-和Fe（CN）4-，測試前溶液通高純N2以除去溶解氧。

1.2.3DNA修飾電極的制備取50 mL 0.5 mol/L Tris溶液配置成DNA的Tris溶液，然后將硫代乙酸自組裝單分子膜（SAMs）修飾后的金電極放入配置好的DNA的Tris溶液中靜置24 h。然后取出用水沖洗后即得到含有Au/硫醇/DNA雙層膜（Hybrid Bilayer Membranes，HBMs）的硫代乙酸自組裝層膜修飾電極（DNA/SAM/Au），再依次用無水乙醇、雙蒸水沖洗，以除去表面物理吸附的分子，然后用高純N2吹干表面溶劑，立即進(jìn)行電化學(xué)測試。測試溶液中含有相同濃度的Fe（CN）63-和Fe（CN）64-，測試前溶液通高純N2以除去溶解氧。

2　結(jié)果與分析

2.1裸金電極電化學(xué)行為表征

Fe（CN）63-和Fe（CN）64-與DNA具有很強(qiáng)的相互作用。以此為指示劑來表征DNA修飾電極，結(jié)果表明，裸金電極在5 mmol/L的K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中表現(xiàn)出可逆的電化學(xué)行為（圖1 a），其反應(yīng)由Fe（CN）63-/ Fe（CN）64-的擴(kuò)散所控制，循環(huán)伏安曲線呈現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰，當(dāng)金被自組裝膜修飾后，在-0.2～0.8 V的掃描范圍內(nèi)Fe（CN）63-/Fe（CN）64-的氧化還原峰完全消失，并呈現(xiàn)倒“S”形的極化曲線。

2.2硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極電化學(xué)行為表征

（a，裸金電極；b，巰基乙酸修飾電極；c，DNA修飾電極。）圖1 DNA修飾電極在5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中的循環(huán)伏安

硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極在5mmol/L的K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中還原峰與氧化峰的差值明顯降低，表現(xiàn)出可逆的電化學(xué)行為（圖1 b），其反應(yīng)由Fe（CN）63-/Fe（CN）64-的擴(kuò)散所控制。結(jié)果表明，硫醇自組裝膜對界面電子轉(zhuǎn)移有強(qiáng)烈的阻礙作用，當(dāng)電極表面修飾自組裝膜后，F(xiàn)e（CN）63-/Fe（CN）64-溶液中的循環(huán)伏安行為則由可逆變成了循環(huán)伏安曲線上的氧化峰與還原峰之間的間距減小，峰變平緩，電極反應(yīng)的可逆性變差。

2.3Au/硫代乙酸/DNA混合雙層膜修飾的金電極電化學(xué)行為表征

Au/硫代乙酸/DNA混合雙層膜修飾的金電極在5 mmol/L的K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中的電化學(xué)行為，其反應(yīng)仍由Fe（CN）63-/Fe（CN）64-的擴(kuò)散所控制（圖1）。結(jié)果表明，相比較硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極曲線b而言，圖象沒有太大的變化，但當(dāng)電位為0.3～0.8 V時，峰電流還是有所降低；-0.2～0.3 V時，峰電流有所升高；0.8 V時，電流與硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極時的相同；0.3 V時，氧化還原峰電流達(dá)到一致；-0.2 V時，電流值增大到40 μA，電極反應(yīng)的可逆性相比裸金電極明顯變差。

3　小結(jié)與討論

1）應(yīng)用循環(huán)伏安法研究了硫代乙酸SAM修飾金電極，并利用二次自組裝技術(shù)制備了Au/硫醇/DNA混合雙層膜（HBMs）的金電極在含F(xiàn)e（CN）63-/ Fe（CN）64-溶液中的電化學(xué)行為，并對其進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，硫代乙酸自組裝單分子膜使DNA和可能與DNA相互作用的生物物質(zhì)避免了與金電極表面的直接接觸，從而防止可能發(fā)生的變性，同時利用自組裝單分子膜對電極的封閉作用，可以消除由吸附產(chǎn)生的對金屬電極的毒化。無“針孔”缺陷的SAM修飾電極在Fe（CN）63-/Fe（CN）64-溶液中表現(xiàn)出倒“S”形的極化曲線，還原峰與氧化峰差值較大；硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極在Fe（CN）63-/Fe（CN）64-溶液中，曲線平緩，還原峰與氧化峰差值小，電極反應(yīng)的可逆性變差，這種現(xiàn)象可能與自組裝膜自身的膜電阻有關(guān)。

2）由于膜電阻的存在，使測得的電極電位包括了在膜上的電位降。當(dāng)膜的電阻足夠大時，幾乎所有的電位降都集中在膜上，這時所表現(xiàn)出來的CV行為將主要反映膜的電阻隨電位變化特性［8］。Au /硫代乙酸/ DNA混合雙層膜修飾的金電極在Fe（CN）63-/Fe（CN）64-溶液中曲線平緩，與硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極相比，圖象沒有太大的變化，但峰電流有所降低。這可能是因?yàn)橛捎赟AM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其為DNA的固定提供了一個穩(wěn)定、均一、反應(yīng)位點(diǎn)多的理想表面，并可根據(jù)不同的需要，提供不同官能團(tuán)的表面，SAM 使DNA和可能與DNA相互作用的生物物質(zhì)避免與電極表面的直接接觸，從而可以防止可能發(fā)生的變性。同時利用SAM對電極的封閉作用，可以消除由吸附產(chǎn)生的對金屬電極的毒化。采用在金表面先修飾硫代乙酸SAM，再自組裝Au/硫醇/DNA混合雙層膜（HBMs）是可靠和較理想的DNA修飾電極的制備方法，制備的DNA修飾電極將在電化學(xué)基因傳感器和DNA與其他分子的相互作用研究等方面有應(yīng)用價值。

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（本文責(zé)編：楊杰）

作者簡介：張環(huán)（1979—），女，甘肅會寧人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事分析化學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究工作。聯(lián)系電話：（0）13919859386。E-mail：bxy0516@sina.com。

收稿日期：2015-05-27；

修訂日期：2015-06-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2015.09.008

中圖分類號：O657.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-1463（2015）09-0021-03