鐘　浩，高貴賓，潘雁紅，吳良如*

(1.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江杭州310012；2.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江杭州310012)

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部分茶竿竹亞屬竹種親緣關系的熒光AFLP分析

鐘浩1,2，高貴賓1,2，潘雁紅1,2，吳良如1,2*

(1.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江杭州310012；2.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江杭州310012)

摘要：利用熒光AFLP技術，選擇EcoRⅠ/MseⅠ酶切組合，應用16對(EcoRⅠ+3)/(MseⅠ+3)引物組合進行選擇性擴增，檢測9個茶竿竹亞屬竹種基因組DNA多態(tài)性。結果共獲得1 473條譜帶，平均每對引物92條，其中多態(tài)性條帶1 092條，PPB為74.1%。聚類結果表明，正種茶竿竹及其4個變種以相似系數(shù)0.78聚在一起，其中鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹之間的相似系數(shù)達到最高為0.88，從分子水平上佐證了鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹是正種茶竿竹的2個變種。

關鍵詞：正種茶竿竹；AFLP；多態(tài)性；聚類；相似系數(shù)

正種茶竿竹(Pseudosasaamabilis)，屬禾本科竹亞科(Bambusoideae Nees)矢竹屬(Pseudosasa)茶竿竹組的模式種[1]，是我國特產的珍貴竹種之一，竹稈通直、節(jié)平、壁厚、光滑、堅韌、材質優(yōu)良，可制作各種竹器家具、雕刻裝飾、釣魚竿、滑雪杖、旗竿、籬笆等。正種茶竿竹竹材纖維含量達53.2%，適于造紙和制人造絲漿[2]。竹材經沙洗加工后，潔白如象牙，不易被蟲蛀且耐腐蝕性強，燃燒后竹灰潔白不成炭，因此又被稱為“沙白竹”、“鋼竹”，是我國傳統(tǒng)出口商品竹，在國際市場頗負盛名。正種茶竿竹主產于廣東、福建、湖南、廣西等省區(qū)的丘陵平原或河流沿岸及山坡地帶，近年江蘇、浙江有引種栽培，生長尚佳，模式標本采自廣東省肇慶市廣寧縣[3]。

中國植物志記載，茶竿竹亞屬有16種5變種[1]，均分布在我國華南、華東地區(qū)之南部，而徐英寶[2]等報道，廣東省肇慶市懷集縣有3個變種，即正種茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.amabilis)、鐵厘茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.ferrea)和白水茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.peshuiensis)，但后2個變種在植物志中沒有記載，也未見相關文獻報道。本文利用AFLP分子標記對部分茶竿竹亞屬竹種進行親緣關系分析，從分子水平探討廣東省肇慶市懷集縣鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹的分類地位。

擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphisms，AFLP)是1993年由荷蘭科學家Vos等發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的方法，是一種以PCR和RFLP為基礎的DNA指紋圖譜技術[4]，已廣泛應用于竹類植物遺傳多樣性和親緣關系的研究[5]。

1材料與方法

1.1材料

收集了包括茶竿竹在內的5個變種，即正種茶竿竹(P.amabilis)、福建茶竿竹(P.amabilisvar.convexa)、薄籜茶竿竹(P.amabilisvar.tenuis)、鐵厘茶竿竹(P.amabilisvar.ferrea)和白水茶竿竹(P.amabilisvar.peshuiensis)；還采集了茶竿竹亞屬的其它4個種，即斑籜茶竿竹(P.notate)、筆竿竹(P.guangxianensis)、近實心茶竿竹(P.subsolida)和尖籜茶竿竹(P.acutivagina)(表1)。其中福建茶竿竹、薄籜茶竿竹、筆竿竹、近實心茶竿竹、斑籜茶竿竹和尖籜茶竿竹采自福建華安竹種園；正種茶竿竹、鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹采自廣東省肇慶市懷集縣。采集的樣品均經過福建省華安縣林業(yè)局華安竹種園鄒躍國高級工程師的鑒定。采集竹子嫩葉的混合樣，經變性硅膠快速干燥后帶回實驗室置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　材料名稱及編號

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取采用改良的CTAB法提取9個竹種的基因組DNA[6]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，取1 μL在1%TAE瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測DNA的質量，然后定量至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2AFLP分析采用EcoRⅠ/MseⅠ酶切組合，對Vos等發(fā)明的方法[7]進行了優(yōu)化。EcoRⅠ和MseⅠ對應的接頭和預擴增引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。接頭序列：EcoRⅠ左接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，右接頭5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；MseⅠ左接頭5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，右接頭5′-TACTCAGGACTCAT-3′。選擴增引物試劑盒(AFLP? IRDye 700 Infrared Dye Selective Amplification Kit)購自基因有限公司，其中EcoRⅠ選擴引物由IRDye 700熒光標記。選擴增產物在Li-cor4300 DNA遺傳分析系統(tǒng)上樣電泳并自動進行數(shù)據(jù)采集。

1.2.3數(shù)據(jù)處理由Li-cor4300 DNA遺傳分析系統(tǒng)采集到的特征數(shù)據(jù)矩陣計算單位引物多態(tài)性條帶和多態(tài)性條帶百分率(Percentage of Polymorphic Band,PPB)。利用NTSYS-pc(version2.10e)對數(shù)據(jù)進行分析，用SAHN Clustering進行非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析，并構建遺傳多樣性聚類圖譜。

2結果與分析

2.1AFLP擴增片段的多態(tài)性

從常用的8×8對引物中篩選出16對擴增效果較好的引物(表2)對9個樣品進行AFLP檢測，由Li-cor4300 DNA遺傳分析系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)可知，其擴增產物的分布范圍在50～700 bp，圖1是引物組合E-AAC/M-CTC的擴增結果。16對引物共擴增出1 473個條帶，平均每對引物92條，其中多態(tài)性條帶1 092條，PPB為74.1%。不同引物對的擴增效果差異很大，E-ACC/M-CAC擴增條帶最豐富，擴增出134個條帶；E-ACA/M-CTT擴增條帶最少，僅擴增出45個條帶。不同引物組合的PPB相差較大，從61.2%到87.2%不等，其中E-ACG/M-CAC引物組合的PPB最高為87.2%(表2，圖1)。

表2　AFLP引物組合的多態(tài)性分析

M：IRDye? 700 Sizing Standard-50-700 bp；1～9：見表1　M:IRDye? 700 Sizing Standard-50-700 bp;1～9:See Tab.1圖1　AFLP引物組合E-AAC/M-CTC對9個茶竿竹亞屬竹種的擴增結果Fig.1　The amplification result of 9 Chagan-Bamboo species by AFLP primercombination E-AAC/M-CTC

2.2聚類結果與分析

采用SM系數(shù)，當遺傳相似系數(shù)取閾值0.65時，可以分為兩個大組。第一大組包括正種茶竿竹及其4個變種和茶竿竹亞屬的其它2個種(筆竿竹和尖籜茶竿竹)，第二大組包括茶竿竹亞屬的另2個種(近實心茶竿竹和斑籜茶竿竹)。第一大組中，正種茶竿竹及其4個變種以相似系數(shù)0.78聚在一起形成一個小組(圖2中紅框所示，以下稱茶竿竹小組)，其中懷集縣的2個茶竿竹變種鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹相似系數(shù)最高，為0.88，親緣關系也最近。正種茶竿竹及其變種先與筆竿竹聚在一起，然后再與親緣關系較遠的尖籜茶竿竹聚在一起形成第一大組。

3結論與討論

從聚類結果看，支持經典的茶竿竹亞屬分類[1]。如筆竿竹與茶竿竹小組之間的相似系數(shù)達到了0.74，親緣關系也較近，兩者在形態(tài)上相似之處在于籜片線狀披針形，基部稍向內收窄，籜鞘背部無斑點。主要區(qū)別為茶竿竹竿籜無籜耳，但有數(shù)條直立而先端波曲的繸毛，而筆竿竹竿籜具橢圓形的籜耳，其上有繸毛，形態(tài)上的關系得到了本文研究結果的支持。

懷集縣的2個茶竿竹變種鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹之間的相似系數(shù)達到最高的0.88，從分子水平上佐證了它們是茶竿竹的2個變種，而且體現(xiàn)了一定的地理特異性(均采自廣東省肇慶市懷集縣)。

圖2　9個茶竿竹亞屬竹種基于SM相似系數(shù)的AFLP譜帶UPGMA聚類圖Fig.2　The UPGMA dendrogram of 9 Chagan-Bamboo species using SM coefficients

第二大組與第一大組之間的相似系數(shù)只有0.65，這也支持經典的分類系統(tǒng)，兩者在形態(tài)上的主要區(qū)別為第一大組籜鞘背部無斑點，而第二大組籜鞘背部多少有些具斑點。第二大組的近實心茶竿竹和斑籜茶竿竹以相似系數(shù)0.73聚在一起，兩者在形態(tài)上的主要區(qū)別有：近實心茶竿竹籜鞘的斑點不很清楚，籜鞘背部無毛，籜耳為小點狀，葉耳不明顯，具數(shù)條短繸毛；斑籜茶竿竹籜鞘的斑點明顯，籜鞘背部被疏密不勻向下貼伏的刺毛，鞘基部還生有淺黃色絨毛，籜耳小，半圓形，密被細柔毛，耳緣生數(shù)條硬剛毛，葉耳和繸毛俱缺。

傳統(tǒng)的AFLP分子標記多采用垂直板電泳和銀染法檢測[8-10]，本研究采用的熒光標記引物AFLP法，檢測的靈敏度高于銀染法，而且可運用SAGAMX軟件進行電泳圖自動讀帶并轉化為0、1矩陣，然后進行分析，全過程自動化完成，與人工讀取膠板銀染法相比，很大程度上降低了系統(tǒng)誤差與隨機誤差，提高了工作效率[11]。

本文的研究結果表明，AFLP分子標記是一種茶竿竹亞屬內系統(tǒng)學檢測的有效工具，當根據(jù)形態(tài)鑒別有困難時，可提供一種候選的，也是可靠的鑒別方法。

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An Analysis of Genetic Relationship among Some Chagan-Bamboo

Species by Using Fluorescent AFLP

ZHONG Hao1,2,GAO Gui-bin1,2,PAN Yan-hong1,2,WU Liang-ru1,2*

(1.China National Bamboo Research Center,Hangzhou 310012,China;2.Key Laboratory of High Efficient Processing of Bamboo of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China)

Abstract:Fluorescent amplified fragment length polymorphisms (AFLP) was used to study the DNA diversity of 9 Chagan-Bamboo species.Genomic DNA was digested withEcoRⅠ andMseⅠ enzymes and amplified with 16 (EcoRⅠ+3)/(MseⅠ+3) primer combinations.In the 9 samples,16EcoRⅠ -MseⅠ AFLP primer combinations produced 1 473 legible bands (92 bands per primer combination),of which 1 092 were polymorphic bands,the percentage of polymorphic band (PPB) was 74.1%.The cluster analysis of AFLP indicated thatPseudosasaamabilisand its 4 varieties belonged to one small group (their similar coefficient was 0.78),in which the similar coefficient betweenPseudosasaamabilisvar.ferreaandPseudosasaamabilisvar.peshuiensiswas 0.88.This proves thatPseudosasaamabilisvar.ferreaandPseudosasaamabilisvar.peshuiensisare two varieties ofPseudosasaamabilis.

Key words:Pseudosasaamabilis;AFLP;diversity;cluster;similar coefficient

作者簡介：鐘浩(1984—)，男，助理研究員，碩士生，主要從事竹子分子遺傳研究，E-mail:13706710845@163.com；*通信作者：吳良如，副研究員，E-mail:boteatree@163.com。

基金項目：國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心研究基金項目(ZXJJ201207)和浙江省科技計劃項目(2014F10047)

收稿日期：2015-05-29修回日期：2015-09-17

中圖分類號：Q943.2

文獻標志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)06-1033-04

鐘浩，高貴賓，潘雁紅，等.部分茶竿竹亞屬竹種親緣關系的熒光AFLP分析[J].江西農業(yè)大學學報，2015，37(6)：1033-1036.