汪建峰 王 勇（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

基于系統(tǒng)-合成生物學(xué)的人工細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)

汪建峰 王 勇
（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

汪建峰，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)閺?fù)雜天然產(chǎn)物異源合成系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。

E-mail:jfwang@sibs.ac.cn

在過(guò)去的十多年里，研究人員利用合成生物學(xué)方法在模式微生物底盤(pán)中設(shè)計(jì)和重建了一系列重要天然化合物的異源合成模塊，大大拓展了微生物發(fā)酵在珍稀藥物、食品添加劑、生物能源和精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。為了實(shí)現(xiàn)異源產(chǎn)物的高產(chǎn)量和高得率，必須綜合運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)方法，對(duì)異源模塊進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，強(qiáng)化底盤(pán)細(xì)胞的前體和能量合成，并改善模塊的適配性，最終實(shí)現(xiàn)異源化合物的高產(chǎn)。文章綜述了近年來(lái)在人工細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)上的進(jìn)展。

王勇，博士，中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”研究員，主要研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的合成生物學(xué)。

E-mail:yongwang@sibs.ac.cn

在過(guò)去的十多年里，研究人員利用合成生物學(xué)方法在大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等常見(jiàn)的模式微生物底盤(pán)（Chassis）中設(shè)計(jì)和重建了一系列重要萜類(lèi) 、苯丙烷素類(lèi) 、聚酮類(lèi) 等天然化合物的異源合成模塊，成功賦予了原有底盤(pán)細(xì)胞生產(chǎn)重要外源化合物的能力，大大拓展了微生物發(fā)酵在珍稀藥物、食品添加劑、生物能源和精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。為能夠快速響應(yīng)環(huán)境變化并以最經(jīng)濟(jì)的狀態(tài)生存，由自然進(jìn)化而來(lái)的初始底盤(pán)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)往往存在著大量支路代謝、可逆代謝、補(bǔ)償代謝等途徑，而且在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、酶活水平等各個(gè)層次受到極其復(fù)雜、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控。因此，初始底盤(pán)細(xì)胞內(nèi)源代謝僅能向異源代謝模塊提供極少量的前體和能量來(lái)進(jìn)行異源產(chǎn)物的生產(chǎn)。為了實(shí)現(xiàn)異源產(chǎn)物的高產(chǎn)量和高得率，除了需要對(duì)異源模塊進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化外 ，另一個(gè)迫切的研究?jī)?nèi)容是如何利用各種工程策略強(qiáng)化底盤(pán)細(xì)胞的前體和能量合成，并改善內(nèi)源模塊和異源模塊的適配性（如空間尺度的接近、時(shí)間尺度的同步等）。經(jīng)典誘變育種方法隨機(jī)性強(qiáng)、定向篩選困難、過(guò)程周期漫長(zhǎng)。傳統(tǒng)代謝工程的方法僅對(duì)局部代謝網(wǎng)絡(luò)中單個(gè)或者少數(shù)靶點(diǎn)進(jìn)行改造，難以達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。大腸桿菌與釀酒酵母等底盤(pán)細(xì)胞具有遺傳背景清晰、遺傳操作手段成熟等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)這些模式微生物，研究人員已經(jīng)建立了各種成熟的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法與工具，如組學(xué)分析 、全基因組規(guī)模代謝模型（GSMM）、in silico的代謝網(wǎng)絡(luò)分析 等，同時(shí)也開(kāi)發(fā)了一整套合成生物學(xué)研究工具和技術(shù)，如精細(xì)可控的表達(dá)調(diào)控元件、基因回路DNA裝配和染色體工程技術(shù) 等。因此，結(jié)合運(yùn)用這些系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)方法，可以快速鑒定全基因組規(guī)模潛在遺傳靶點(diǎn)，并對(duì)大量靶點(diǎn)實(shí)施精準(zhǔn)、快速的改造與集成，最終大大提高菌株改造的效率和周期，實(shí)現(xiàn)異源化合物的高產(chǎn) 。

1 全基因組規(guī)模靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與診斷

1.1 全基因組規(guī)模in silico細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

隨著大量微生物全基因組測(cè)序和注釋工作的完成，研究人員對(duì)微生物復(fù)雜的全基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)有了更全面深入的認(rèn)識(shí)?；诨?蛋白質(zhì)-生化反應(yīng)的相互關(guān)系，將全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)抽象為一系列按一定計(jì)量關(guān)系運(yùn)行的生化反應(yīng)，然后可以利用計(jì)量系數(shù)矩陣模型建立基因組規(guī)模代謝模型（GSMM）。以GSMM為基礎(chǔ)，運(yùn)用一系列基于預(yù)先假定的約束條件（如最大菌體生長(zhǎng)、最大產(chǎn)物合成）進(jìn)行全細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)流量分析，如通量平衡分析（FBA）、最小代謝調(diào)整分析（MOMA）等，可以發(fā)現(xiàn)大量能改善目標(biāo)產(chǎn)物合成的潛在途徑或基因，特別是一些與產(chǎn)物合成相距較遠(yuǎn)、表觀上無(wú)直接關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)。相比于傳統(tǒng)方法，這些信息可以更理性地指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)更多有效的基因靶點(diǎn)，減少實(shí)驗(yàn)的盲目性。自從Edwards等 2000年發(fā)表了第一個(gè)GSMM以來(lái)，經(jīng)過(guò)十年的發(fā)展，至今已建立了超過(guò)100個(gè)物種的基因組尺度代謝模型（表1）。隨著對(duì)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)認(rèn)識(shí)的加深，更多的信息被整合到了模型中，大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物的代謝網(wǎng)絡(luò)模型被不斷更新，為更全面、徹底地預(yù)測(cè)細(xì)胞表型和遺傳靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

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目前全基因組規(guī)模的in silico細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到了傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)菌株和一些天然化合物異源合成工程菌株的改造中。研究人員通過(guò)對(duì)全基因組模型的進(jìn)一步修正和約束算法的優(yōu)化，不斷強(qiáng)化預(yù)測(cè)的全面性和準(zhǔn)確性。Alper等 利用MOMA方法，預(yù)測(cè)并鑒定了大腸桿菌中能提高番茄紅素合成的基因敲除靶點(diǎn)。隨后，Choi等 開(kāi)發(fā)了限制目標(biāo)流量的流量掃描分析方法（FSEOF），不僅預(yù)測(cè)了大腸桿菌中能提高番茄紅素合成的敲除靶點(diǎn)，同時(shí)也獲得了一些潛在的強(qiáng)化靶點(diǎn)。筆者實(shí)驗(yàn)室為了進(jìn)一步提高in silico預(yù)測(cè)效率，以經(jīng)典的FBA和MOMA算法為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)了流量分布比較分析（FDCA）和LMOMA-based兩種新的算法 。首先，F(xiàn)DCA算法是以基因組范圍的代謝模型為基礎(chǔ)，分別采用最大菌體生長(zhǎng)和最大產(chǎn)物合成作為約束條件，利用FBA方法計(jì)算各自約束條件下代謝通量分布，通過(guò)進(jìn)一步比較這兩種狀態(tài)下的流量分布情況，找出所有顯著上調(diào)或下調(diào)的節(jié)點(diǎn)（反應(yīng)），這些節(jié)點(diǎn)即是理論上潛在改造靶點(diǎn)。因此，F(xiàn)DCA實(shí)質(zhì)是in silico代謝流量組的比較分析，它可以從全基因組規(guī)?？焖僬业接绊懩硞€(gè)表型的所有潛在敲除、強(qiáng)化或弱化靶點(diǎn)。其次，LMOMA-Based算法以LMOMA（線性MOMA）方法為基礎(chǔ)發(fā)展的，意在實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組范圍模型中的所有靶點(diǎn)進(jìn)行深入的疊加敲除分析。該算法的每一輪敲除都是對(duì)全基因組范圍所有靶點(diǎn)的一次全掃描敲除分析，在找到該輪敲除中

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表1 幾種重要底盤(pán)微生物的全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型

1.2 基于組學(xué)數(shù)據(jù)比較分析的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)診斷

基于GSMM計(jì)量模型的in silico代謝網(wǎng)絡(luò)方法可以快速鑒定理論上的敲除、弱化或強(qiáng)化靶點(diǎn)，但目前這種計(jì)量模型分析僅僅反應(yīng)某種理想狀態(tài)下靜態(tài)的代謝流量分布，無(wú)法體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)（如RNA豐度、酶濃度、代謝物濃度等）的動(dòng)態(tài)變化和復(fù)雜調(diào)控，因而無(wú)法指導(dǎo)開(kāi)展更精細(xì)的遺傳改造，如基因表達(dá)劑量?jī)?yōu)化、基因表達(dá)時(shí)間上的開(kāi)關(guān)等，同時(shí)也無(wú)法反映實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞受到的各種環(huán)境脅迫作用，如菌株的耐受性等。借助全基因組范圍或某個(gè)核心代謝模塊的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組、代謝流量組等分析，可有效掌握細(xì)胞內(nèi)酶、底物、中間代謝物及產(chǎn)物濃度的動(dòng)態(tài)變化。這樣的系統(tǒng)診斷分析對(duì)如何進(jìn)一步設(shè)計(jì)高產(chǎn)菌株和選取最有效的改造策略具有重要意義。

細(xì)胞內(nèi)RNA水平直接影響轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)重要的基因表達(dá)過(guò)程。通過(guò)基于微陣列芯片和RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組分析，可以快速鑒定特定條件下大量基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，從而發(fā)現(xiàn)未知的基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律以及許多與耐受性相關(guān)靶點(diǎn)。Foo 等 利用比較轉(zhuǎn)錄組方法分析了大腸桿菌宿主在外源添加高濃度異戊烯醇環(huán)境下基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了與氧化脅迫響應(yīng)、通用脅迫響應(yīng)、熱激響應(yīng)和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的8個(gè)靶點(diǎn)的強(qiáng)化表達(dá)能夠提高宿主對(duì)異戊烯醇耐受性。進(jìn)一步對(duì)高產(chǎn)異戊烯醇工程菌株測(cè)試，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)靶點(diǎn)過(guò)表達(dá)能夠強(qiáng)化異戊烯醇的合成，其中蛋氨酸合成調(diào)節(jié)子MetR能使異戊烯醇產(chǎn)量提高55%。Hess等 借助轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)各種不同環(huán)境條件下具有不同異戊二烯產(chǎn)量的枯草芽孢桿菌的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究。他們將其中的213個(gè)受調(diào)控基因的表達(dá)與異戊二烯的產(chǎn)量關(guān)聯(lián)起來(lái)，并構(gòu)建了相關(guān)預(yù)測(cè)模型。這些相關(guān)的分析可以有效地指導(dǎo)菌株的后續(xù)改造及培養(yǎng)條件優(yōu)化。

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基于選擇性監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（selectedreaction monitoring，SRM）的靶向蛋白質(zhì)組方法可以直接有效地對(duì)相關(guān)代謝途徑中酶豐度進(jìn)行定量 。相對(duì)于轉(zhuǎn)錄組分析，蛋白質(zhì)組信息能夠更加直觀地反映基因表達(dá)狀況和細(xì)胞代謝狀態(tài)。Redding-Johanson等 利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)表達(dá)酵母來(lái)源MVA途徑的產(chǎn)萜類(lèi)大腸桿菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究。他們發(fā)現(xiàn)酵母來(lái)源甲羥戊酸激酶（MK）和磷酸甲羥戊酸激酶（PMK）是潛在的代謝瓶頸?；谠摻Y(jié)果，通過(guò)密碼子優(yōu)化和替換強(qiáng)啟動(dòng)子的方法從翻譯和轉(zhuǎn)錄兩個(gè)方面有效地提高了MK和PMK蛋白在細(xì)胞內(nèi)水平，從而使紫槐二烯的產(chǎn)量提高了3倍。代謝組分析技術(shù)的進(jìn)步也進(jìn)一步便于代謝網(wǎng)絡(luò)中各種代謝物的定量。Weaver等 結(jié)合采用靶向蛋白組和代謝組分析方法對(duì)產(chǎn)萜類(lèi)大腸桿菌中MVA前體途徑和紫槐二烯異源合成模塊中的酶和代謝分別進(jìn)行了定量分析。結(jié)合局部網(wǎng)絡(luò)中酶和代謝物的濃度信息，他們利用常微分方程構(gòu)建了該代謝通路的動(dòng)力學(xué)模型。通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行全局敏感性分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重要的信息：①紫槐二烯合成酶的濃度與紫槐二烯的產(chǎn)量相關(guān)；②解除FPP對(duì)MK酶的反饋抑制作用，不影響產(chǎn)物合成。他們又進(jìn)一步證實(shí)了由動(dòng)力學(xué)模型分析得出的以上兩個(gè)結(jié)論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。隨著各種組學(xué)分析方法可靠性和檢測(cè)通量的增加，結(jié)合運(yùn)用這些方法可以幫助更準(zhǔn)確地理解更大范圍的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)行為，更加便于對(duì)工程菌株進(jìn)行靶點(diǎn)診斷分析。

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2 細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的高效遺傳操作及DNA裝配方法

系統(tǒng)生物學(xué)的方法可以為高產(chǎn)菌株的設(shè)計(jì)提供大量全基因組范圍的潛在靶點(diǎn)。如何快速地對(duì)所有潛在靶點(diǎn)及各種靶點(diǎn)組合進(jìn)行精細(xì)改造與測(cè)試，并將所有關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行集成以最終獲得滿足工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株，是亟待解決的問(wèn)題。過(guò)去十多年的合成生物學(xué)研究，積累了許多精細(xì)可控的基因表達(dá)調(diào)控元件以及元件的定量設(shè)計(jì)方法，為精細(xì)的調(diào)控基因的表達(dá)提供了豐富的元件。同時(shí)，高效的基因編輯技術(shù)也被開(kāi)發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)染色體范圍多靶點(diǎn)快速改造與集成 。以大腸桿菌系統(tǒng)為例，傳統(tǒng)同源重組打靶質(zhì)粒構(gòu)建，重組效率低。以噬菌體重組系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的λ大腸桿菌等重組技術(shù)直接用外源線性雙鏈或單鏈DNA分子打靶染色體上大量靶點(diǎn)，大大縮短了大腸桿菌基因每次敲除的周期，提高了重組效率。尤其是線性單鏈DNA作為靶分子時(shí)，重組效率達(dá)到了90%。以線性單鏈DNA打靶為基礎(chǔ)，Wang等 進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了功能更強(qiáng)大的多元自動(dòng)化染色體改造方法（multiplex automated genome engineering， MAGE），通過(guò)設(shè)計(jì)自動(dòng)化可重復(fù)循環(huán)進(jìn)行染色體改造的實(shí)驗(yàn)裝備，在數(shù)天內(nèi)快速完成對(duì)染色體內(nèi)大量靶點(diǎn)重新洗牌。筆者以大腸桿菌番茄紅素合成工程菌為優(yōu)化對(duì)象，采用MAGE技術(shù)對(duì)潛在的24個(gè)與萜類(lèi)合成有關(guān)的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)的RBS區(qū)域的序列進(jìn)行了進(jìn)化改造。3天后, 從數(shù)以億計(jì)的突變克隆中成功地篩選到了高產(chǎn)菌株。該方法實(shí)現(xiàn)了染色體上大量位點(diǎn)的并行改造，大大提高了基因編輯的效率。CRISPR/Cas技術(shù)是被最新開(kāi)發(fā)的一個(gè)更為簡(jiǎn)易高效的染色體編輯技術(shù) 。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas （CRISPR associated）是天然存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種免疫系統(tǒng)。CRISPR/ Cas系統(tǒng)由crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白組成。crRNA負(fù)責(zé)識(shí)別入侵的靶點(diǎn)序列，crRNA/tracrRNA與Cas9蛋白結(jié)合，然后引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割。近年來(lái)，研究人員利用CRISPR/Cas特異性識(shí)別和染色體雙鏈切割功能，將CRISPR/ Cas開(kāi)發(fā)成高效地基因組敲除技術(shù)，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、真菌及細(xì)菌等系統(tǒng)中取得成功。該方法重組效率極高，能夠有效地進(jìn)行多靶點(diǎn)的同時(shí)改造，因此將在高產(chǎn)菌株全基因組范圍靶點(diǎn)的改造中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。對(duì)于染色體序列的修改，利用人工設(shè)計(jì)的非編碼RNA可以更加方便地調(diào)控相應(yīng)基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的抑制 。

除高效的染色體編輯技術(shù)外，復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化也對(duì)DNA大片段組裝乃至染色體拼接提出了更高的要求 。近年來(lái)，研究人員開(kāi)發(fā)了一系列高效的體外拼接方法，包括生物磚系統(tǒng)（BioBricks、BglBricks） 、In-FusionTM同源重組 、Gibson等溫法 、非序列及非連接依賴性克隆（SLIC） 等，都能夠很好地用于幾十kb的DNA片段。相比于體外連接方法，借助酵母強(qiáng)大的同源重組能力，可更快速地實(shí)現(xiàn)許多帶有特定同源末端的DNA片段連接成大片段的DNA分子，且具有相當(dāng)高的精確性，該方法顯示出了巨大的應(yīng)用前景 。目前，研究人員已經(jīng)成功利用該技術(shù)重構(gòu)了番茄紅素的生物合成基因簇、宏基因組來(lái)源的聚酮生物合成基因簇等。Wingler等 在酵母系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了迭代重組方法，實(shí)現(xiàn)了多基因途徑的快速組裝和優(yōu)化。Sleight等 也開(kāi)發(fā)了隨機(jī)BioBrick組裝方法進(jìn)行基因回路和番茄紅素途徑的隨機(jī)裝配，結(jié)合高通量篩選方法實(shí)現(xiàn)途徑的快速優(yōu)化。雖然DNA合成技術(shù)在組裝長(zhǎng)度、準(zhǔn)確性、高通量、自動(dòng)化、低成本等方面取得了巨大進(jìn)步，但這些技術(shù)仍然存在著各自的缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步的發(fā)展和整合，以適應(yīng)合成生物學(xué)發(fā)展的需要。

3 人造細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的適配與重編程

3.1 代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)適配

對(duì)于自然進(jìn)化而來(lái)的微生物，隨著其生長(zhǎng)階段和環(huán)境的變化，細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)也是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，以滿足細(xì)胞以最經(jīng)濟(jì)的方式運(yùn)行。傳統(tǒng)方法通過(guò)誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子調(diào)控下游合成途徑或強(qiáng)化前體途徑限速步驟基因表達(dá)、抑或是敲除分支途徑基因的方法，雖能在一定程度上提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成，但這些策略無(wú)法使關(guān)鍵基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)地適應(yīng)菌株生長(zhǎng)變化和環(huán)境擾動(dòng)，也無(wú)法使細(xì)胞實(shí)時(shí)地處在前體供應(yīng)與前體消耗的動(dòng)態(tài)平衡下。這些內(nèi)源代謝途徑與下游途徑基因表達(dá)的不適配，往往會(huì)造成細(xì)胞在酶水平和代謝物水平的浪費(fèi)與生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)。如當(dāng)胞內(nèi)前體流量供應(yīng)改善后，若下游途徑的表達(dá)維持不變，會(huì)引起中間代謝物的大量積累并造成細(xì)胞毒性和相關(guān)酶的反饋抑制。反之，當(dāng)胞內(nèi)前體流量供應(yīng)降低后，下游途徑的表達(dá)也可以適量減弱，從而減弱細(xì)胞的負(fù)擔(dān)。因此利用動(dòng)態(tài)的調(diào)控回路，協(xié)同上游途徑和下游途徑的表達(dá)，可以經(jīng)濟(jì)有效地提高菌株產(chǎn)物合成 。針對(duì)這樣的改造目標(biāo)，能響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)特定代謝物的元件以及合成生物學(xué)基因調(diào)控回路是非常重要的改造工具。

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為了實(shí)現(xiàn)這樣的動(dòng)態(tài)調(diào)控，F(xiàn)armer 等 首次在產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌中設(shè)計(jì)了響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)代謝物乙酰磷酸的動(dòng)態(tài)回路，通過(guò)乙酰磷酸胞內(nèi)濃度的動(dòng)態(tài)變化來(lái)調(diào)控番茄紅素下游合成模塊的表達(dá)，有效促進(jìn)了番茄紅素的合成。Xu等 利用了脂肪酰-CoA響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FadR構(gòu)建了基因回路，動(dòng)態(tài)調(diào)控乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合酶的表達(dá)，從而提高菌株脂肪酸合成。但是在多數(shù)情況下，缺乏可用于特定回路設(shè)計(jì)的響應(yīng)元件來(lái)控制和協(xié)同基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法，可以發(fā)現(xiàn)有效的調(diào)控因子用于回路設(shè)計(jì)。研究表明，法呢基焦磷酸（FPP）是倍半萜合成的直接前體, 需要很強(qiáng)的FPP代謝流量才能滿足萜類(lèi)的大量合成需要。但是FPP具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在引入優(yōu)化后的MVA途徑的E. coli萜類(lèi)合成高產(chǎn)菌株中，往往由于下游模塊的表達(dá)水平無(wú)法與FPP供應(yīng)水平相協(xié)同，F(xiàn)PP會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累并造成細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。Dahl等 利用轉(zhuǎn)錄組分析的方法，發(fā)現(xiàn)了能夠?qū)祁?lèi)代謝中間體FPP作出壓力響應(yīng)的調(diào)控元件。利用該調(diào)控元件設(shè)計(jì)了控制紫槐二烯和甲羥戊酸合成途徑的動(dòng)態(tài)回路，有效地促進(jìn)了紫槐二烯的合成。Yuan等 利用實(shí)時(shí)定量PCR （qRT-PCR）的方法分析了釀酒酵母菌株中相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ERG11、ERG2、ERG3三個(gè)基因的表達(dá)在胞內(nèi)麥角固醇積累時(shí)是下調(diào)的，并鑒定了受麥角固醇調(diào)控的啟動(dòng)子。當(dāng)利用這些麥角固醇響應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控 ERG9表達(dá)時(shí)，異源萜類(lèi)化合物的產(chǎn)量可以提高2～5倍。

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3.2 代謝網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)化重構(gòu)與適配

為了進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)量，研究人員從細(xì)胞全局網(wǎng)絡(luò)的角度開(kāi)展了菌株的系統(tǒng)化重構(gòu)和適配研究，并取得了一系列的成果。Zhao等 采用啟動(dòng)子工程和模塊化代謝工程策略對(duì)大腸桿菌中心代謝網(wǎng)絡(luò)中涉及萜類(lèi)前體合成、NADPH、ATP供應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)的測(cè)試與集成改造，成功提高了β-胡蘿卜素的合成。Meng等 以大腸桿菌iAF1260模型為基礎(chǔ)，將該全基因組in silico代謝流量分析應(yīng)用到了大腸桿菌萜類(lèi)合成體系優(yōu)化中，并由Wang等 成功鑒定了一系列能提高萜類(lèi)合成的新靶點(diǎn)。利用釀酒酵母的甲羥戊酸途徑進(jìn)行萜類(lèi)的高效合成已經(jīng)比較成熟。為了進(jìn)一步提高釀酒酵母萜類(lèi)合成的能力，Meng和Sun等 以釀酒酵母iMM904全基因組模型為基礎(chǔ)，利用FDCA和MOMA算法，預(yù)測(cè)并獲得了一系列能提高萜類(lèi)合成、但不顯著影響菌體生長(zhǎng)的新的改造靶點(diǎn)。隨后通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)，以很高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度發(fā)現(xiàn)了SER3、SER33、SOR1等10個(gè)靶點(diǎn)的單敲除能夠使萜類(lèi)合成提高8～10倍。此外，為了實(shí)現(xiàn)酵母前體供應(yīng)和下游合成途徑代謝流的平衡，Ding等 采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的方法預(yù)測(cè)并發(fā)現(xiàn)了最高效的GGPP合成酶，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)成功解決了一個(gè)酵母系統(tǒng)紫杉醇關(guān)鍵中間體taxadiene合成的關(guān)鍵瓶頸。

由于異源聚酮合成模塊和底盤(pán)細(xì)胞前體模塊之間的不適配，使得紅霉素大腸桿菌異源合成菌株的效率非常低。為了改善紅霉素等聚酮類(lèi)化合物在大腸桿菌中的合成，筆者研究組以紅霉素前體6dEB合成菌株為基礎(chǔ)，首先結(jié)合運(yùn)用基因組尺度的in silico代謝網(wǎng)絡(luò)分析和比較轉(zhuǎn)錄組分析系統(tǒng)地研究了聚酮合成模塊（以紅霉素前體6dEB合成模塊為例）和內(nèi)源代謝模塊在細(xì)胞代謝和基因轉(zhuǎn)錄兩個(gè)層次的相互作用 ?；蚪M尺度的in silico代謝網(wǎng)絡(luò)分析反映了在理論條件下細(xì)胞達(dá)到6dEB最大合成產(chǎn)率的代謝流量分布情況及潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)。以最大生長(zhǎng)速率（Vmax，growth）（理想狀況下）和6dEB最大合成速率（Vmax，synthesis）（目標(biāo)狀況下）作為目標(biāo)函數(shù)，通過(guò)基于FDCA方法的in silico代謝網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了大量潛在的改造靶點(diǎn)。另一方面，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析在啟動(dòng)6dEB合成相關(guān)基因表達(dá)并添加丙酸鹽后，發(fā)現(xiàn)共有629個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)生明顯變化。這些基因分布在40個(gè)不同的代謝模塊中。隨后采用了snRNA技術(shù)，快速地對(duì)大量潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)改造，通過(guò)弱化提高聚酮化合物產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)20多個(gè)可使產(chǎn)量提高20%以上的新靶點(diǎn) 。

相比于復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)改造，利用合成生物學(xué)方法在體外重構(gòu)局部代謝網(wǎng)絡(luò)，可以更好地研究網(wǎng)絡(luò)特性、指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)。Zhu等 首先在體外重構(gòu)了萜類(lèi)前體合成甲羥戊酸途徑和法尼希下游合成，并對(duì)該系統(tǒng)各組分進(jìn)行分析。然后以此為基礎(chǔ)，通過(guò)在大腸桿菌中定量分析和表達(dá)甲羥戊酸途徑與法尼希合成途徑中的各個(gè)重要酶，成功地提高了大腸桿菌法尼希的合成。

4 結(jié) 論

隨著DNA合成與裝配技術(shù)越來(lái)越成熟，大量天然化合物異源合成途徑被成功組裝，高效微生物異源體系設(shè)計(jì)的焦點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到如何通過(guò)對(duì)細(xì)胞全局網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)菌株的高產(chǎn)，并最終可用于生產(chǎn)實(shí)踐。系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)分別為菌株細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析診斷與遺傳改造提供了強(qiáng)大的工具與方法。系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，特別是蛋白質(zhì)組、代謝物組等檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析方法的日益成熟使生物工程師們可以對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞代謝過(guò)程有更實(shí)時(shí)、全局的診斷。基于這些數(shù)據(jù)建立相關(guān)的動(dòng)態(tài)模型，分析這些整合了動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)、細(xì)胞調(diào)控特性的全基因組網(wǎng)絡(luò)模型，可以更加準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)一系列新的改造靶點(diǎn)和靶點(diǎn)組合，這將徹底改變傳統(tǒng)以隨機(jī)誘變和篩選為主的黑箱方法來(lái)進(jìn)行工業(yè)菌株改造 。同時(shí)，合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為菌株的改造提供了強(qiáng)大、高效的DNA操作方法、染色體編輯技術(shù)，以及理性的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)方法。這些合成生物學(xué)方法和策略為快速實(shí)現(xiàn)菌株改造和測(cè)試奠定了基礎(chǔ)。因此，基于系統(tǒng)-合成生物學(xué)的人工細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)與優(yōu)化方法將成為后基因組時(shí)代微生物工業(yè)菌株優(yōu)化的重要策略。

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