劉 暢 劉雙江（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

莽草酸合成途徑元件庫(kù)：現(xiàn)狀與未來

劉 暢 劉雙江
（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

劉暢，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所助理研究員，主要從事Corynebacterium glutamicum莽草酸途徑的合成生物學(xué)研究。

E-mail:liuc@im.ac.cn

莽草酸廣泛存在于自然界中，并在醫(yī)藥、工業(yè)、能源領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值。莽草酸途徑是植物和微生物合成芳香族氨基酸等重要化合物的關(guān)鍵代謝路徑。近年來，合成生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，莽草酸途徑已經(jīng)成為合成生物學(xué)重要的研究對(duì)象。生物元件的挖掘、搜集、表征及標(biāo)準(zhǔn)化等一直是合成生物學(xué)研究的重要方向之一，文章從傳統(tǒng)元件的收集與整理、標(biāo)準(zhǔn)化元件庫(kù)的批量發(fā)掘與表征、通用元件的列舉，以及元件組裝模塊的實(shí)例分析等方面討論了莽草酸途經(jīng)元件庫(kù)相關(guān)研究工作的現(xiàn)狀與未來發(fā)展前景。

作者簡(jiǎn)介

劉雙江，博士，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所研究員，中國(guó)科學(xué)院百人計(jì)劃、國(guó)家杰出青年基金獲得者。主要研究領(lǐng)域是環(huán)境微生物學(xué)，以Corynebacterium glutamicum和Comamonas testorsteroni為材料，圍繞芳烴類化合物的代謝途徑、代謝調(diào)控、趨化機(jī)制等方面，開展系統(tǒng)的生理和遺傳學(xué)研究；近年來圍繞Corynebacterium glutamicum莽草酸途徑開展合成生物學(xué)研究。

E-mail:liusj@im.ac.cn

合成生物學(xué)研究中，復(fù)雜生命系統(tǒng)的各個(gè)單元可以通過分析、歸納、解耦等方法被抽象化為基本的元件，這些基本元件可以進(jìn)一步改造為標(biāo)準(zhǔn)化生物元件，繼而研究人員可以像工程師一樣以生物學(xué)知識(shí)和控制理論為基礎(chǔ)，精確設(shè)計(jì)具有特定功能的標(biāo)準(zhǔn)化生物模塊或生物系統(tǒng)，通過工程學(xué)的方法進(jìn)行模塊組裝和系統(tǒng)構(gòu)建。在這個(gè)層層遞進(jìn)的組裝過程中，生物元件作為最基礎(chǔ)的“零件”，是合成生物學(xué)發(fā)展的基材。生物元件的挖掘、搜集、表征及標(biāo)準(zhǔn)化等一直是合成生物學(xué)研究的重要方向之一 。2003年，首個(gè)標(biāo)準(zhǔn)生物元件注冊(cè)庫(kù)（http:// parts.igem.org/Main_Page）在麻省理工學(xué)院建立，這為全世界科學(xué)家提供了一個(gè)交流、開發(fā)和存儲(chǔ)生物元件的開放平臺(tái)。通常所說的生物元件包括：①調(diào)控元件，如啟動(dòng)子（promoter）、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）、終止子（terminator）等；②催化元件，即編碼具有催化功能基因的DNA序列；③結(jié)構(gòu)元件，如骨架蛋白和生物大分子支架（scaffold）；④操控和感應(yīng)元件，如基因開關(guān)（genetic switch）、生物傳感器（sensor）、絕緣子（insulator）等。這些生物元件多數(shù)來源于自然界，通過篩選、分離、表征和標(biāo)準(zhǔn)化后獲得；亦有一部分是通過對(duì)天然生物元件進(jìn)行合理設(shè)計(jì)、改造與修飾后獲得的新功能的元件。當(dāng)前，大量基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋與功能驗(yàn)證等數(shù)據(jù)信息，加之各種生物信息學(xué)軟件的出現(xiàn)與發(fā)展，都為生物元件的收集、鑒定與構(gòu)建提供了豐富的信息資源；元基因組技術(shù)的興起與發(fā)展又使得從占微生物資源99%以上的未知微生物中挖掘更多的生物元件成為可能 。

圖1 莽草酸途徑化學(xué)反應(yīng)過程

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1 莽草酸及莽草酸途徑

莽草酸（shikimic acid）在自然界中廣泛存在，其不僅是植物和微生物生物合成芳香族氨基酸、葉酸、泛醌、維生素K2等芳香族化合物的重要前體，還是工業(yè)生產(chǎn)吲哚衍生物、手性藥物（如抗病毒藥達(dá)菲）的關(guān)鍵合成原料，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 莽草酸的生產(chǎn)主要有植物提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵等方法，近幾十年來隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的方法以環(huán)保、高產(chǎn)、不受原材料限制等優(yōu)勢(shì)，成為工業(yè)化生產(chǎn)莽草酸的優(yōu)勢(shì)技術(shù) 。莽草酸途徑（shikimate pathway）是普遍存在于植物和微生物體內(nèi)的一條聯(lián)系中心碳代謝途徑與芳香族氨基酸等重要化合物體內(nèi)合成的關(guān)鍵合成路徑 ，由于莽草酸是第一個(gè)被鑒定出來的合成途徑中間體，故此得名。 如圖1所示，該途徑起始物是磷酸戊糖途徑的中間物4-磷酸赤蘚糖（E4P）和糖酵解的中間物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），經(jīng)4步反應(yīng)，生成莽草酸，之后經(jīng)3步反應(yīng)生成分支酸，分支酸經(jīng)不同的酶催化，分別生成酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸3種芳香族氨基酸 。莽草酸途經(jīng)長(zhǎng)期備受關(guān)注，原因在于一方面莽草酸途徑是植物和微生物體內(nèi)生成芳香族氨基酸及多種功能化合物的重要途徑，對(duì)該途徑進(jìn)行研究與改造對(duì)于芳香族氨基酸及其他衍生物的工業(yè)生產(chǎn)具有實(shí)際價(jià)值；另一方面是由于該途徑不存在于人和高等動(dòng)物體內(nèi)，因此莽草酸途經(jīng)常被作為抗菌除草的藥物靶點(diǎn)，指導(dǎo)新藥的設(shè)計(jì)與開發(fā)。目前，對(duì)莽草酸途經(jīng)的研究主要集中在：①對(duì)莽草酸途經(jīng)中各酶進(jìn)行發(fā)掘鑒定、晶體結(jié)構(gòu)解析以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)表征等；②針對(duì)不同的莽草酸途徑酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)理性設(shè)計(jì)抗菌除草等藥物的特異性靶點(diǎn)；③以提高特定化合物產(chǎn)量（如莽草酸、芳香族氨基酸及其他芳香族化合物等）為目標(biāo)，對(duì)該途徑中的催化與調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)與定向改造。

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2 莽草酸途徑的工程化改造

目前，對(duì)莽草酸生產(chǎn)菌株的工程化改造主要集中在大腸桿菌（E. coli）中進(jìn)行，也有一部分工作是以枯草芽孢桿菌（B. subtilis） 、弗式檸檬酸桿菌（C. freudii） 和谷氨酸幫桿菌（C. glutamicum）為工程菌株進(jìn)行的。改造的策略主要以基因工程、代謝工程等為手段，通過理性化的設(shè)計(jì)進(jìn)行改造，包括以下幾個(gè)方面：①阻斷莽草酸合成的下游途徑以積累莽草酸 ；②發(fā)現(xiàn)莽草酸合成的限速步驟，并對(duì)相應(yīng)的酶進(jìn)行過表達(dá)，或進(jìn)行改造以解除反饋抑制 ；③通過對(duì)中心碳代謝途徑進(jìn)行改造，或者通過對(duì)PTS系統(tǒng)進(jìn)行敲除和替代 ，使轉(zhuǎn)酮酶基因tktA和磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsA基因過表達(dá)以增加莽草酸代謝途徑起始底物PEP和E4P的供應(yīng)量 ；④針對(duì)大腸桿菌莽草酸合成過程中會(huì)產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物如奎尼酸、脫氫莽草酸等，研究者做了諸多嘗試將副產(chǎn)物產(chǎn)量降到最低，以保證莽草酸的純度，包括失活莽草酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ShiA，失活奎尼酸/莽草酸脫氫酶YdiB，以及利用分解代謝物阻遏原理通過增加葡萄糖濃度或使用葡萄糖類似物來抑制副產(chǎn)物的生成 。其中，莽草酸產(chǎn)量提高最為顯著的工作是由Chandran等 在2003年完成的，研究人員通過在莽草酸激酶（AroL和AroK）和3-磷酸甘油酸脫氫酶缺失的E. coli工程菌RB791 serA::aroB aroL::Tn10 aroK::CmR的基礎(chǔ)上，對(duì)PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因ptsH 和ptsI進(jìn)行失活，得到E. coli SP1.1pts，并將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）來源的ATP 依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系（包括一個(gè)葡萄糖協(xié)助基因glf和一個(gè)葡糖激酶基因glk）在該菌株中進(jìn)行異源表達(dá)以繞過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程中對(duì)PEP的消耗，此外又過表達(dá)編碼解除反饋抑制的DAHP合酶基因aroFfbr和編碼轉(zhuǎn)酮醇酶I基因tktA。在進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)，莽草酸濃度提升到84g/L，產(chǎn)率達(dá)到0.33mol / mol葡萄糖。這是目前在實(shí)驗(yàn)室水平利用工程菌生產(chǎn)莽草酸的最高產(chǎn)量，在之后的數(shù)年里，利用傳統(tǒng)代謝工程手段對(duì)莽草酸合成途徑進(jìn)行改造與優(yōu)化似乎進(jìn)入了一個(gè)瓶頸期。究其原因，筆者認(rèn)為一方面對(duì)如大腸桿菌這類成熟的工程菌的莽草酸途徑的研究已經(jīng)十分透徹，對(duì)它的改造與修飾工作也幾近極致；另一方面，對(duì)于這個(gè)普遍存在于細(xì)菌中的莽草酸合成途徑的催化或者調(diào)控元件，缺乏廣泛的了解與深層次的挖掘，這大大局限了對(duì)該途徑進(jìn)行改造與優(yōu)化時(shí)的思路與策略，特別是在異源途徑組裝與精細(xì)調(diào)控方面，取得的進(jìn)展十分有限。如Knop等將煙草（Nicotiana tabacum）來源的編碼奎尼酸脫水酶和莽草酸脫氫酶雙功能酶的aroDE基因在大腸桿菌中異源表達(dá)以替代大腸桿菌中的aroD和aroE時(shí)，并沒有如預(yù)期有效避免副產(chǎn)物3-脫氫莽草酸的積累。對(duì)莽草酸合成途徑中各類生物元件缺乏全局性的認(rèn)識(shí)是現(xiàn)階段工程改造莽草酸合成途徑所面臨的一個(gè)壁壘，近年來合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，又讓研究者看到了將生物合成莽草酸向前繼續(xù)發(fā)展下去的美好前景。

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3 莽草酸途徑的元件庫(kù)

3.1 酶元件庫(kù)的發(fā)掘與收集

如前所述，生物元件是合成生物學(xué)的基材。 2010年，Arcuri等 建立了一個(gè)專門收集莽草酸途徑酶的數(shù)據(jù)庫(kù)SKPDB （http://lsbzix.rc.unesp.br/skpdb），該數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建之初主要是對(duì)莽草酸途徑各酶結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行整理，用于設(shè)計(jì)以莽草酸途徑為標(biāo)靶的藥物分子。其記錄的各酶元件數(shù)據(jù)不僅包含酶蛋白分子三維結(jié)構(gòu)，還包括了它們的序列信息、功能以及文獻(xiàn)等，為各元件作為合成生物學(xué)研究對(duì)象，提供了良好的信息基礎(chǔ)。目前，該數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)包含了8902個(gè)莽草酸途徑酶的信息，這一數(shù)字還在不斷增加。2014年，李文均等基于1249個(gè)原核生物基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)組為基礎(chǔ)，以Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中莽草酸途徑中的各酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?yàn)槟０妫肏MMERv.3.0軟件對(duì)所有可能的參與莽草酸途徑的酶進(jìn)行了挖掘，并在提取了所有在結(jié)構(gòu)域上與已知各酶相似的蛋白氨基酸序列后，又進(jìn)一步對(duì)其中可能包含的非目標(biāo)序列進(jìn)行了剔除，獲得不同類群微生物中莽草酸合成途徑相關(guān)酶元件數(shù)量，結(jié)果如表1所示 ，這為今后可能的莽草酸途徑元件庫(kù)的構(gòu)建與元件選取奠定了很好的基礎(chǔ)。同時(shí)，此次序列搜集工作不僅對(duì)傳統(tǒng)莽草酸途徑的全部7個(gè)酶進(jìn)行了充分挖掘，還對(duì)古菌中莽草酸合成的另一條變異途徑（DKFP途徑）所涉及的酶進(jìn)行一個(gè)全面的分析比對(duì)，為莽草酸途徑的異源組裝與改造提供了更為豐富的、潛在的生物元件資源。第一個(gè)真正意義上的莽草酸合成途徑元件庫(kù)的構(gòu)建，由劉雙江實(shí)驗(yàn)室于近期完成。劉暢等 以來自大腸桿菌的I型脫氫奎尼酸脫水酶和來自谷氨酸棒桿菌的II型脫氫奎尼酸脫水酶的氨基酸序列為模板，以E-value≤10E-10為過濾條件，在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)所有原核微生物中可能的脫氫奎尼酸脫水酶進(jìn)行序列BLAST搜索，得到462個(gè)脫氫奎尼酸脫水酶的同源序列。之后，參考文獻(xiàn)報(bào)道、分類代表性、菌株特殊性、I型與II型酶分布比例等因素，從這462個(gè)同源序列中選擇了38個(gè)基因進(jìn)行了序列優(yōu)化和Biobricks標(biāo)準(zhǔn)化處理，并進(jìn)行了全基因合成。38個(gè)人工合成的基因進(jìn)一步在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)純化和高通量的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，這是第一次批量的對(duì)莽草酸合成途徑中的催化單元進(jìn)行系統(tǒng)的表征，構(gòu)建了第一個(gè)脫氫奎尼酸脫水酶標(biāo)準(zhǔn)元件庫(kù)（統(tǒng)一的限制性酶切接口進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)表征）。如表2所示，該元件庫(kù)具有很好的動(dòng)力學(xué)多樣性，元件酶活參數(shù)數(shù)值寬闊，為后續(xù)利用元件庫(kù)進(jìn)行莽草酸合成途徑異源組裝與替換提供了多種選擇可能性 。

除了上述系統(tǒng)鑒定莽草酸合成途徑生物元件外，在早期工作中被單獨(dú)鑒定并表征的各個(gè)酶及其同源基因，經(jīng)過收集整理、統(tǒng)一描述、標(biāo)準(zhǔn)化之后，也可成為酶元件，充實(shí)相應(yīng)酶的元件庫(kù)。BRENDA網(wǎng)站（http://www. brenda-enzymes.org/index.php）作為一個(gè)開放的平臺(tái)，收集整理了各種已經(jīng)報(bào)道的酶蛋白的各項(xiàng)參數(shù)與特性，為元件庫(kù)的挖掘提供了便捷的條件。表3列出了一部分文獻(xiàn)報(bào)道過的莽草酸途徑酶的信息。生物元件除了從自然界中篩選分離的元件外，通過對(duì)生物元件進(jìn)行合理設(shè)計(jì)、改造與修飾而獲得的人工元件也是酶元件庫(kù)重要的組成部分。從合成生物學(xué)的角度來看，在以往的對(duì)莽草酸途徑工程化改造的過程中，研究者們就已經(jīng)開發(fā)和構(gòu)建了很多這樣的酶元件，只要在后

表1 莽草酸合成途徑中各酶在原核微生物中的分布情況

表1 莽草酸合成途徑中各酶在原核微生物中的分布情況

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莽草酸合成途徑元件庫(kù)：現(xiàn)狀與未來續(xù)的工作中對(duì)這些元件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并將這些元件進(jìn)行系統(tǒng)地整理，就可以構(gòu)建一個(gè)功能多樣、應(yīng)用價(jià)值巨大的酶元件庫(kù)。如作為莽草酸合成途徑起始步驟的催化酶DAHP合酶，其在大腸桿菌中有3個(gè)同工酶，分別是AroF、AroG和AroH，3種酶分別受3種芳香族氨基酸的反饋抑制，該酶也因此成為莽草酸合成的一個(gè)關(guān)鍵限速步驟?？紤]到這點(diǎn)，研究者們通過突變株篩選、氨基酸序列截短以及關(guān)鍵位點(diǎn)突變等方法先后獲得了多個(gè)解除反饋抑制的DAHP合酶，其中有些酶不僅解除了反饋抑制，酶活參數(shù)也得到了一定的提高。同時(shí)，利用這些酶元件對(duì)莽草酸途徑進(jìn)行改造時(shí)，莽草酸產(chǎn)量也得到了有效的提高。這也再一次說明，設(shè)計(jì)與改造更多有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的酶元件，并在合成生物學(xué)的準(zhǔn)則下構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的元件庫(kù)，是將合成生物學(xué)更好地應(yīng)用于莽草酸生物合成改造中一個(gè)行之有效的策略。

圖2 谷氨酸棒桿菌中定向設(shè)計(jì)aroB、aroD、aroE 和 aroG 4個(gè)基因的RBS元件庫(kù)及相對(duì)熒光強(qiáng)度

圖2 谷氨酸棒桿菌中定向設(shè)計(jì)aroB、aroD、aroE 和 aroG 4個(gè)基因的RBS元件庫(kù)及相對(duì)熒光強(qiáng)度

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表2 脫氫奎尼酸脫水酶元件庫(kù)中各元件的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表2 脫氫奎尼酸脫水酶元件庫(kù)中各元件的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

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表2 脫氫奎尼酸脫水酶元件庫(kù)中各元件的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（續(xù)表）

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表3 部分報(bào)道過的參與莽草酸途徑的酶元件的酶活參數(shù)

3.2 調(diào)控元件庫(kù)的發(fā)掘與收集

在合成生物學(xué)研究中，對(duì)設(shè)計(jì)的模塊或者系統(tǒng)進(jìn)行定量調(diào)控是主要內(nèi)容，因而調(diào)控元件的挖掘與收集就變得十分重要。劉雙江實(shí)驗(yàn)室的張博等 在對(duì)谷氨酸棒桿菌中的莽草酸合成途徑進(jìn)行合成生物學(xué)改造時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的RBS對(duì)酶的產(chǎn)量與表達(dá)效率有很大影響，為此構(gòu)建了針對(duì)莽草酸合成中的4個(gè)酶AroG、AroB、AroD和AroE的4個(gè)RBS元件庫(kù)。元件庫(kù)的構(gòu)建是以谷氨酸棒桿菌中RBS保守序列AAAGG為基礎(chǔ)，對(duì)其后面的6～9個(gè)堿基進(jìn)行了飽和突變，所得突變RBS序列被分別聯(lián)入包含AroB-eGFP、AroD-eGFP、AroE-eGFP 和AroG-eGFP融合蛋白的質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)入菌株中進(jìn)行篩選，并分別隨機(jī)挑取了146、52、59和54克隆進(jìn)行測(cè)序和熒光強(qiáng)度的測(cè)定，最終獲得了容量分別為33、43、49和42的aroB、aroD、aroE和aroG的RBS元件庫(kù)（圖2），這些元件庫(kù)具有很好的多樣性，其中的RBS強(qiáng)弱變化顯著。通過對(duì)這4個(gè)元件庫(kù)中的RBS進(jìn)行不同的組合優(yōu)化，最終通過替換4個(gè)酶的RBS元件，將谷氨酸棒桿菌中的莽草酸產(chǎn)量提高了近54倍。

除RBS外，啟動(dòng)子作為十分重要的調(diào)控元件，一直是對(duì)代謝途徑進(jìn)行改造時(shí)首要考慮的目標(biāo)。然而與蛋白質(zhì)及RBS這些元件不同的是，啟動(dòng)子元件往往是底盤細(xì)胞特異性的，而非代謝途經(jīng)特異性的。也就是說，不同的底盤細(xì)胞，同樣的啟動(dòng)子序列其強(qiáng)度可能會(huì)存在較大差異；相同的底盤細(xì)胞，同一個(gè)啟動(dòng)子在不同的代謝途徑中發(fā)揮作用時(shí)，其強(qiáng)度差別一般不大。值得慶幸的是，在利用微生物進(jìn)行莽草酸合成的研究中，所應(yīng)用的底盤細(xì)胞目前主要集中在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、弗式檸檬酸桿菌和谷氨酸幫桿菌。這些菌株在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中均有著重要地位，各個(gè)菌株都已經(jīng)有很多的啟動(dòng)子元件庫(kù)存在 ，這些元件庫(kù)多數(shù)可以直接應(yīng)用于莽草酸途徑的改造。

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3.3 通用元件

在上述提到的RBS元件庫(kù)構(gòu)建中，婁春波等 于2012年利用了一個(gè)基于核酶設(shè)計(jì)的絕緣子RiboJ，用于消除上游調(diào)控序列對(duì)蛋白翻譯的影響，從而達(dá)到定量調(diào)控的目的。事實(shí)上，類似的通用性很強(qiáng)的合成生物學(xué)調(diào)控元件還有很多，如基因開關(guān) 、基因振蕩器 、生物傳感器等 ，這些元件大多已經(jīng)在其他代謝途徑改造中得到了廣泛的應(yīng)用，鑒于它們都具有很好的通用性及適配性，因此均可以看成調(diào)控元件庫(kù)的一部分，在未來可以廣泛地應(yīng)用到對(duì)莽草酸途徑改造的設(shè)計(jì)中。

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4 莽草酸合成途徑模塊的組裝

生物元件庫(kù)的建設(shè)是為了莽草酸途徑模塊化的組裝與應(yīng)用，生物元件庫(kù)的應(yīng)用效果，還需要在實(shí)踐中進(jìn)行檢驗(yàn)。上述提到的生產(chǎn)莽草酸的大腸桿菌工程菌改造工作已經(jīng)證實(shí)了利用解除反饋抑制的AroF替換原途徑中的DAHP合酶可以顯著提高莽草酸產(chǎn)量；而將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來源的非PEP依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系異源替換大腸桿菌中的PTS系統(tǒng)也可以顯著提高莽草酸產(chǎn)量。最近，張博等首次將古菌中特有的莽草酸合成變異途徑DKFP（6-deoxy-5-ketofructose 1-phosphate）組裝入谷氨酸棒桿菌中，實(shí)現(xiàn)了莽草酸產(chǎn)量的提高 。該研究以DKFP合酶、ADTH合酶和DHQ合酶的氨基酸序列為模板，在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)并篩選了多個(gè)同源序列，之后通過逐個(gè)表征各個(gè)元件并根據(jù)異源表達(dá)情況和酶學(xué)特性對(duì)酶元件進(jìn)行篩選，最終確定以1個(gè)丙酮醛合酶、2個(gè)DKFP合酶（MMP0293、MM0714）、2個(gè)ADTH合酶（MMP0686、MM1271）和1個(gè)DHQ合酶（MM1272）為元件，以排列組合的方式組裝了3組異源模塊。將這3組模塊分別裝配入敲除莽草酸激酶的谷氨酸棒桿菌底盤細(xì)胞后，確定效果最好的一組異源途徑，對(duì)莽草酸的產(chǎn)量提高了59%。該工作雖然對(duì)最終莽草酸產(chǎn)量提高效果并非十分顯著，但這是首次完全以合成生物學(xué)的思路出發(fā)，通過一系列的途經(jīng)設(shè)計(jì)、元件篩選與模塊組裝流程，完成了對(duì)莽草酸合成途徑的異源裝配，這在一定程度上驗(yàn)證了異源模塊組裝對(duì)莽草酸途徑改造的潛在應(yīng)用價(jià)值與前景。

5 總結(jié)與展望

目前，莽草酸途徑的合成生物學(xué)研究還處于起步階段，對(duì)元件庫(kù)的搜集與挖掘工作也做得不夠完善與精細(xì)，標(biāo)準(zhǔn)化程度不高，對(duì)元件庫(kù)的挖掘工作多數(shù)還停留在對(duì)其生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的收集與分析，只有很少的一部分進(jìn)行了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)表征，而這其中又有相當(dāng)一部分元件并沒有進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的設(shè)計(jì)，這大大限制了元件的應(yīng)用性。目前，應(yīng)用較廣泛的標(biāo)準(zhǔn)化方法有Biobricks、Bglbricks等，通用的標(biāo)準(zhǔn)化方法對(duì)設(shè)計(jì)與開發(fā)新元件庫(kù)至關(guān)重要。

此外，為了使莽草酸途徑元件庫(kù)得到更好的利用，還需要解決一些元件適配性和通用性的問題。如不同底盤細(xì)胞在翻譯過程中存在密碼子偏好性等情況，不加以注意，同一個(gè)蛋白元件在不同的底盤細(xì)胞中所表現(xiàn)出來的特性可能會(huì)有較大差別。劉暢等 為了增加脫氫奎尼酸脫水酶元件庫(kù)的適配性，在元件序列進(jìn)行全化學(xué)合成之前，對(duì)堿基序列進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化，去除了在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中存在的稀有密碼子，這樣該元件庫(kù)就可以同時(shí)應(yīng)用于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的莽草酸途徑組裝。同時(shí)，如果想進(jìn)一步提高該元件庫(kù)的通用性，就需要考慮更多底盤細(xì)胞的密碼子偏好性情況，這在一定程度上也增加了元件庫(kù)構(gòu)建的難度。此外，一些調(diào)控元件也存在專一性較強(qiáng)或底盤細(xì)胞適配性低等問題，影響了元件庫(kù)的應(yīng)用范圍。除少數(shù)一些通用功能元器件（絕緣子、基因開關(guān)等），多數(shù)調(diào)控元件（啟動(dòng)子、RBS、5'-UTR等）的適配性與通用性受較多因素的限制。如RBS的強(qiáng)度與其后面所調(diào)控的基因序列密切相關(guān) ，而同樣的啟動(dòng)子在不同的底盤細(xì)胞中，強(qiáng)度也可能有較大的差別 。再如一些在大腸桿菌中廣泛使用的強(qiáng)啟動(dòng)子，在谷氨酸棒桿菌中的強(qiáng)度則低很多；而在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建的啟動(dòng)子元件庫(kù)，其在大腸桿菌中的強(qiáng)度則要低幾個(gè)數(shù)量級(jí) 。要想解決這些問題，首先需要對(duì)這些調(diào)控元件的作用原理與調(diào)控機(jī)理有更透徹更深入的了解，并且需要通過在實(shí)際科研中不斷探索、設(shè)計(jì)與改造以獲得更多通用性更好的調(diào)控元件?？傊粩嗵岣咴?kù)的適配性和通用性是未來莽草酸元件庫(kù)設(shè)計(jì)與構(gòu)建研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。對(duì)于催化元件動(dòng)力學(xué)特性在模塊構(gòu)建和代謝網(wǎng)絡(luò)的適配性，目前還鮮有研究報(bào)道。

莽草酸途徑的合成生物學(xué)研究的最終目的是以工程學(xué)的思想設(shè)計(jì)莽草酸合成途徑，以大量的元件庫(kù)為基材，通過功能模塊進(jìn)行組裝與底盤細(xì)胞優(yōu)化，最終獲得高效生產(chǎn)莽草酸或其相關(guān)衍生物的微生物菌株。在這一過程中，元件庫(kù)的構(gòu)建是基礎(chǔ)，如何利用這些元件庫(kù)進(jìn)行功能模塊的組裝與優(yōu)化則是一項(xiàng)更為復(fù)雜和艱巨的任務(wù)。目前雖然已經(jīng)有一些模塊組裝的工作被報(bào)道，但不管是在模塊的精確組裝與定量控制方面，還是在莽草酸產(chǎn)量的提高方面，與既定目標(biāo)還相距甚遠(yuǎn)，還有許多工作有待完成 。

［本研究獲得國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973計(jì)劃”）項(xiàng)目“新功能人造生物器件的構(gòu)建與集成”（2012CB721100）子課題“功能模塊的集成與測(cè)試”（2012CB721104）的資助。］

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