王雪平　戴光耀　馬亮亮　羅玉賢　赫建平　顧福杭

新輔助放化療前后低位直腸癌癌旁組織TRAIL的表達(dá)情況

王雪平戴光耀馬亮亮羅玉賢赫建平顧福杭

【摘要】目的研究腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體( TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)在低位直腸癌癌旁組織新輔助放化療前后的表達(dá)情況。方法選取2011年6月至2013年10月低位直腸癌患者60例，分別于放化療前活檢及放化療手術(shù)后取材癌旁組織，利用免疫組織化學(xué)SP法分別檢測放化療前后TRAIL的表達(dá)情況。結(jié)果新輔助放化療后TRAIL在癌旁組織的陽性表達(dá)率較放化療前升高40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05)。結(jié)論TRAIL的表達(dá)情況與腫瘤的分期密切相關(guān)(經(jīng)放化療后腫瘤降期)，提示通過檢測患者癌旁組織的TRAIL的表達(dá)，或有助于判斷腫瘤患者的預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】TRAIL;低位直腸癌;新輔助放化療; TNM分期

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

TRAIL即腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體。最早由Wiley等［1］在1995年及1996年P(guān)itti等［2］克隆出來并被逐漸認(rèn)知。TRAIL屬TNF超家族成員，TRAIL通過觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞凋亡［3］。TRAIL廣泛表達(dá)于正常人的各種組織，在各種消化道腫瘤中則會出現(xiàn)表達(dá)缺失或低表達(dá)。如胰腺癌［4］、結(jié)直腸癌等。TRAIL作為抑癌基因在直腸正常組織中高表達(dá)，而在直腸癌癌旁組織及癌組織中則依次遞減，大量試驗證明了TRAIL可作為臨床新的敏感免疫組化參考指標(biāo)［1－3］，新輔助放化療的引入，降低了直腸癌局部復(fù)發(fā)率，同時提高了保肛率，增加了患者的生存時間。新輔助放化療前后TRAIL在低位直腸癌癌旁組織中的表達(dá)情況筆者尚未見國見報道，本文就我院相關(guān)研究報告如下。

1　資料與方法

1．1一般資料選取我院2011年6月至2013年10月低位直腸癌患者60例，其中男33例，女27例;年齡19～80歲，平均年齡58．5歲。患者入組前身體狀況整體評估可行新輔助放化療，活檢病理限定為T3期中分化腺癌，同時滿足影像及腔內(nèi)超聲雙重檢查均提示無遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移之條件，分別于同步放化療前后取材癌旁組織(指距病灶2 cm的組織)，并分別檢測放化療前后癌旁組織中TRAIL的表達(dá)水平。

1．2標(biāo)本制備及主要試劑活檢組織離體后用蒸餾水立刻清洗迅速取材。取材后即刻固定于10%中性甲醛溶液中。鼠抗人TRAIL抗體購于美國Santa Cruz公司;鼠及兔SPN免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購于中國中山公司。

1．3方法

1．3．1免疫組化SP法: TRAIL出現(xiàn)概率:細(xì)胞漿明顯小于細(xì)胞核，TRAIL陽性是細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。參照Wiley等［1，5］的方法進(jìn)行全面評估，即包括染色強度和染色范圍，即在每個視野中，計數(shù)要超過500個細(xì)胞并對細(xì)胞染色的強度進(jìn)行半定量分析。采用奧林巴斯顯微鏡40×50觀察組織圖像，并通過攝像頭和數(shù)字化的軟件對產(chǎn)生免疫反應(yīng)的組織總面積進(jìn)行定量分析，通過反應(yīng)的程度(范圍)和強度計算，最終以染色強度及范圍的乘積確定得分; TRAIL的陽性率，染色程度即TRAIL陽性染色所百分率。TRAIL陽性參照則采用已知陽性切片，陰性參照則以PBS替換一抗?？贵w濃度TRAIL為1∶50，以PBS溶液代替一抗做空白對照，操作按照試劑盒說明逐步進(jìn)行。

1．3．2放療:患者于模擬定位機(jī)以俯臥位定位，直腸內(nèi)沖入造影劑80～120 ml，顯影后觀察直腸以上腸段有無癌瘤發(fā)生，首先確定各邊界范圍。野前緣達(dá)膀胱后壁，野后緣達(dá)骨外0．5 cm，后野達(dá)骨盆外1．0 cm，下界達(dá)會陰，上界達(dá)骶1，放療劑量45 Gy/20～25次，縮野時追加10～15 Gy。放療時間一般為5周左右。期間考慮放療的不良反應(yīng)，根據(jù)副作用的強度決定放療的具體時間。如果期間有空白放療期則順延放療時間。

1．3．3化療:根據(jù)NCCN指南，每日據(jù)體表面積計算用藥劑量，口服卡培他濱1 250 mg/m2，2次/d，7周左右。根據(jù)服藥后的藥物耐受情況隨時調(diào)整卡培他濱片(希羅達(dá))的劑量。如出現(xiàn)劇烈惡心、頑固腹瀉等情況則對癥治療無效時減少藥物劑量，

此次試驗中未發(fā)生因各種原因而中途離組情況，

僅有少量患者出現(xiàn)輕度放化療不良反應(yīng)，經(jīng)積極對癥治療后順利完成放化療，期間未介入其他治療，如生物治療、中醫(yī)藥治療等。

1．4結(jié)果判定免疫組化根據(jù)染色反應(yīng)的深度及陽性細(xì)胞的數(shù)量分別記分為0～3分，其中染色深度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)。淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，不著色為0分。陽性細(xì)胞數(shù)＜10% 為0分，10%～45%為1分，46%～70%為2分，＞70%為3分，并根據(jù)這兩項指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)分為4級，即陰性(－)為0分，弱陽性( + )為2分，陽性( + + )為3～4分，強陽性( + + + )為5～6分。

1．5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計軟件，計量資料以珋x±s表示，采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1新輔助放化療后TRAIL在癌旁組織的表達(dá)率比較放化療前TRAIL陽性率20% ( 12/60)，放化療后TRAIL陽性率60%( 36/36)，較放化療前升高40%( P ＜0．05)。

2．2免疫組化各組組織化學(xué)評分分級及例數(shù)見表2。

表2　TRAIL表達(dá)情況參數(shù)分級　n =60，例

2．3放化療前后TRAIL組化染色見圖1。

圖1　TRAIL在直腸癌旁組織放化療前后的活檢表達(dá)情況(免疫組化×2000)

3　討論

直腸癌包括于大腸癌之中，目前大腸癌的患病率及死亡率全球每年2%的速度上升，直腸惡性腫瘤的出現(xiàn)是多環(huán)節(jié)、多因素的復(fù)雜過程。大量研究匯總分析提示，電子結(jié)直腸鏡下腺瘤至癌就需要五年左右的時間［6］。早期癌多數(shù)情況下是可以達(dá)到臨床治愈的，而早期直腸癌可無明顯的臨床癥狀。傳統(tǒng)的影像檢測有局限性如輻射，癌灶小時則易漏診，腸鏡則較為痛苦，且需要腸道準(zhǔn)備，多有不便。因此臨床需要一種較為敏感的檢測指標(biāo)，同時又簡便易行。研究顯示TRAIL在直腸癌、癌旁組織及正常直腸黏膜組織中呈遞增的表達(dá)趨勢，提示直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在TRAIL的缺失，TRAIL能作用各種腫瘤細(xì)胞，可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，與此同時，其對正常細(xì)胞則未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞毒性，其不依賴于p53的誘導(dǎo)凋亡模式，也迥異于放化療所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此其制劑對化療耐藥的癌瘤亦是有其特定的臨床應(yīng)用的可行性。TRAIL的免疫組織化學(xué)SP法研究廣泛而徹底，臨床驗證其可靠性高，并且較為敏感，可以作為直腸癌檢測的靈敏指標(biāo)。

新輔助放化療作為降低腫瘤分期的有效方法，在臨床上應(yīng)用廣泛，其能增加腫瘤手術(shù)切除的機(jī)率，尤其是直腸癌局部放療能明顯降低局部的復(fù)發(fā)率。但有研究顯示單純的新輔助放療并不能有效提高生存率。

NCCN指南中系統(tǒng)闡述了術(shù)前放化療(新輔助放化療)的積極意義［7］，關(guān)于新輔助放化療的研究驗證了其臨床獲益性［6－8］，值得一提的是目前關(guān)于TRAIL制劑聯(lián)合放化療的治療新模式也被提出，Nagane等［9］試驗證實了化療聯(lián)合TRAIL降低了耐藥性，顯示了二者聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢及臨床價值，Marini等［10］研究得出，放療所致的電離輻射可使多種消化道、腺體等的癌細(xì)胞對TRAIL顯示更高的敏感性。關(guān)鋒等［11］則具體就腫瘤壞死因子與單純放療進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。TRAIL聯(lián)合放療也是一新的診療模式。

本文針對低位直腸癌進(jìn)行了TRAIL與新輔助放化療相關(guān)的臨床研究，通過新輔助放化療前后檢測癌旁組織中TRAIL的表達(dá)情況，新輔助放化療提高了其陽性表達(dá)率，但弱陽性者居多，考慮短期內(nèi)基因活化不足，可能存在放化療對于細(xì)胞活性及功能的影響，同時放化療后出現(xiàn)的放射性皮炎及膀胱炎、腸道功能紊亂、性功能障礙，化療性靜脈炎，化療產(chǎn)生的全身不適如酸痛、惡心、腹瀉等諸多不良反應(yīng)，糖尿?。?2］、激素紊亂等體質(zhì)因素等。使部分患者不能堅持規(guī)律治療也影響結(jié)果判定，因此需進(jìn)一步深入研究其機(jī)制。以期發(fā)現(xiàn)新輔助放化療與抑癌基因生物治療的契合點。

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·論著·

收稿日期:( 2013－12－30)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．014

【中圖分類號】R 735．37

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0522－03