郝志云 ， 楊新周 ， 林惠昆， 高楊秋

(德宏師范高等專(zhuān)科學(xué)校 理工系， 云南 德宏 678400)

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云南不同地區(qū)臭靈丹提取物的抗氧化活性

郝志云 ， 楊新周 ， 林惠昆， 高楊秋

(德宏師范高等專(zhuān)科學(xué)校 理工系， 云南 德宏 678400)

為綜合利用臭靈丹，以乙醇、甲醇、丙酮為萃取溶劑，超聲波提取制備提取物，考察云南13個(gè)樣點(diǎn)臭靈丹提取物對(duì)DPPH自由基活性的清除能力，并將其與多種抗氧化劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明：13個(gè)樣點(diǎn)臭靈丹甲醇提取物C1～C13的IC50分別為0.175 3 mg/mL,0.195 3 mg/mL,0.099 40 mg/mL,0.084 74 mg/mL,0.110 7 mg/mL,0.124 6 mg/mL,0.504 6 mg/mL,0.291 5 mg/mL,0.118 1 mg/mL,0.056 35 mg/mL,1.020 mg/mL,0.213 3 mg/mL,0.151 9 mg/mL;乙醇提取物C1～C13的IC50分別為0.652 8 mg/mL,0.463 7 mg/mL,0.209 5 mg/mL,0.225 8 mg/mL,0.354 7 mg/mL,0.395 7 mg/mL,0.849 2 mg/mL,0.852 0 mg/mL,0.358 5 mg/mL,0.143 6 mg/mL,2.580 6 mg/mL,0.724 2 mg/mL,0.455 6 mg/mL;丙酮提取物C1～C13的IC50分別為1.908 9 mg/mL,1.622 9 mg/mL,1.222 3 mg/mL,0.583 7 mg/mL,1.474 9 mg/mL,1.081 7 mg/mL,2.839 7 mg/mL,3.318 8 mg/mL,1.024 0 mg/mL,0.449 9 mg/mL,4.919 5 mg/mL,2.308 5 mg/mL,1.497 5 mg/mL;蘆丁、沒(méi)食子酸、咖啡酸、香草酸和對(duì)香豆酸溶液的IC50分別為0.004 3 mg/mL,0.000 92 mg/mL,0.003 3 mg/mL,0.547 1 mg/mL,2.27 mg/mL；與5種標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化能力相比，依次為沒(méi)食子酸>咖啡酸>蘆丁>甲醇提取物>乙醇提取物>丙酮提取物，云南省13個(gè)地方臭靈丹甲醇提取物抗氧化能力(除樣品11)均大于標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)香豆酸、香草酸；樣品C2、C3、C4、C5、C6、C9、C10、C13乙醇提取物抗氧化能力均大于香草酸、對(duì)香豆酸，丙酮提取物抗氧化能力(除樣品11、12外)均大于香草酸。

臭靈丹； 抗氧化活性； DPPH自由基； 抗氧化劑； 云南

傳統(tǒng)中藥臭靈丹為菊科植物翼齒六棱菊[Laggerapterodonta(DC.) Benth]的干燥地上部分，別名獅子草、臭葉子、六棱菊等，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南及西南部，主產(chǎn)于云南。民間多作為單方治療感冒。現(xiàn)代藥理研究表明，臭靈丹具有鎮(zhèn)痛作用，對(duì)幽門(mén)螺桿菌有抑制作用、還具有抗炎[3]、抗腫瘤[4，5]、祛痰[6]和抗病原微生物[7-8]等作用。目前，對(duì)臭靈丹研究較多的是其黃酮類(lèi)化合物的鑒別及分離、個(gè)別黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性、臭靈丹中金屬元素的含量、臭靈丹中總黃酮含量[1-9]。目前對(duì)于臭靈丹的抗氧化活性方面的報(bào)道甚少，針對(duì)云南是臭靈丹的主要產(chǎn)地，研究云南不同地區(qū)臭靈丹的抗氧化活性具有一定的代表性。臭靈丹在云南是一種常見(jiàn)的中草藥，但是隨著環(huán)境的惡化，數(shù)量逐年減少，筆者比較云南不同地區(qū)臭靈丹不同提取溶劑提取物的抗氧化活性，研究出抗氧化活性最好的提取物，為從云南不同地區(qū)臭靈丹中分離出抗氧化活性物質(zhì)并開(kāi)發(fā)天然抗氧劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

臭靈丹(Laggerapterodonta)藥材采于2013年9-10月，經(jīng)德宏師專(zhuān)林惠昆副教授鑒定為原植物樣品。所采集的樣品見(jiàn)表1. 臭靈丹藥材經(jīng)過(guò)晾干，粉碎，過(guò)篩備用。

1.2 儀器與試劑

V-1100型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，超聲波(SK2200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，電子天平(AR224CN，奧豪斯上海儀器公司)，電熱真空干燥箱ZK-82J型(上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELAN-1100，上海耀裕儀器設(shè)備有限公司)。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,純度>99.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，槲皮素、山奈酚、咖啡酸、蘆丁、沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)浙江華東醫(yī)藥有限公司，純度>98%)，乙醇、甲醇、丙酮等試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.3 DPPH儲(chǔ)備液的制備

精確稱(chēng)取DPPH 10 mg，用無(wú)水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得濃度為DPPH 0.1 mg/mL的儲(chǔ)備溶液。用時(shí)稀釋成濃度為0.024 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 臭靈丹樣品的采集信息

1.4 臭靈丹提取物的制備

乙醇提取物的制備：精確稱(chēng)取2.000 0 g臭靈丹樣品于100 mL的錐形瓶中，加入20 mL無(wú)水乙醇溶液，封口，超聲提取45 min后，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取2次。合并3次濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，定容至25 mL，備用。同法制備臭靈丹甲醇提取物、丙酮提取物。

據(jù)了解，液空中國(guó)將于2020年底前在中國(guó)持續(xù)推廣“SIO前瞻”項(xiàng)目，并且不斷引入液空在其他國(guó)家實(shí)施的成功經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)，為了順應(yīng)“SIO前瞻”項(xiàng)目的實(shí)施，DPC也會(huì)在未來(lái)幾年完成兩方面的重要轉(zhuǎn)型：一是隨著集中運(yùn)行項(xiàng)目的實(shí)施，DPC將通過(guò)安全、可靠、高效的方式，負(fù)責(zé)大范圍內(nèi)集中化運(yùn)行的管理和執(zhí)行；二是通過(guò)運(yùn)用更先進(jìn)的大數(shù)據(jù)分析技術(shù)和新型數(shù)字化工具，實(shí)現(xiàn)更智能、更全面和更快速的決策制定，持續(xù)向“卓越運(yùn)行”邁進(jìn)。

1.5 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

準(zhǔn)確移取DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液4.5 mL，依次加入一定體積的提取物溶液于10 mL比色管中，定容至5 mL，置于暗處30 min，在波長(zhǎng)517 nm下測(cè)定空白DPPH的吸光度值A(chǔ)空白和加入提取物后DPPH的吸光度值為A樣品，按下式計(jì)算自由基清除率(%)[10]。

清除率=(A空白-A樣品)/A空白×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 臭靈丹不同提取物對(duì)DPPH的清除率

2.1.1 乙醇提取物 由圖1和表2可知，臭靈丹乙醇提取物濃度與清除率呈線性關(guān)系?？寡趸芰τ肐C50大小來(lái)表示，IC50越小抗氧化能力越強(qiáng)，根據(jù)不同地區(qū)臭靈丹清除DPPH自由基IC50不同，得出不同地區(qū)臭靈丹樣品乙醇提取物抗氧化能力依次為C10>C3>C4>C5>C9>C6>C13>C2>C1>C12>C7>C8>C11。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C11樣品抗氧化能力較差，可能是因?yàn)樵诓烧^(guò)程中，樣品C11被大雨淋并浸泡過(guò)，其抗氧化物質(zhì)隨雨水流失。

圖1 云南不同地區(qū)臭靈丹乙醇提取物 的DPPH清除率

Fig.1 DPPH scavenging rate of ethanol extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

表2 云南不同地區(qū)臭靈丹乙醇提取物清除DPPH 的回歸方程及IC50值

Table 2 Regression equations and IC50value of DPPH scavenging rate of ethanol extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

樣品Samples回歸方程RegressionequationR2IC50/(mg/mL)C1y=70.454x+4.0040.99910.6528C2y=76.726x+14.410.97960.4637C3y=127.84x+23.2140.98120.2095C4y=168.47x+11.9670.95370.2258C5y=118.12x+8.11920.99270.3547C6y=115.43x+4.33970.99920.3957C7y=53.281x+4.75130.99130.8492C8y=42.07x+14.1550.99180.8520C9y=121.98x+6.27150.99510.3585C10y=228.75x+17.1530.98060.1436C11y=16.516x+7.37940.99532.5806C12y=61.06x+5.78120.99310.7242C13y=85.821x+10.8960.99170.4556

圖2 云南不同地區(qū)臭靈丹甲醇提取物的DPPH清除率

Fig.2 DPPH scavenging rate of methyl extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

2.1.2 甲醇提取物 根據(jù)圖2和表3可知，臭靈丹甲醇提取物濃度與清除率呈線性關(guān)系，不同地區(qū)臭靈丹樣品甲醇提取物抗氧化能力依次為C10>C4>C3>C5>C9>C6>C13>C1>C2>C12>C8>C7>C11。

表3 云南不同地區(qū)臭靈丹甲醇提取物清除DPPH 的回歸方程及IC50值

Table 3 Regression equations and IC50value of DPPH scavenging rate of methyll extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

樣品Samples回歸方程RegressionequationR2IC50/(mg/mL)C1y=273.71x+2.02580.98130.1753C2y=247.12x+1.74080.99380.1953C3y=437.85x+6.4620.99320.09940C4y=563.55x+2.24720.99810.08474C5y=465.76x-1.58020.99440.1107C6y=379.87x+2.66940.99890.1246C7y=88.376x+5.40510.99530.5046C8y=141.59x+8.71990.99670.2915C9y=390.61x+3.88490.99690.1181C10y=730.67x+8.82490.99220.05635C11y=37.237x+12.0110.99271.020C12y=217.49x+3.60280.99720.2133C13y=306.96x+3.35480.99420.1519

圖3 云南不同地區(qū)臭靈丹丙酮提取物的DPPH清除率

Fig.3 DPPH scavenging rate of acetone extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

2.1.3 丙酮提取物 根據(jù)圖3和表4中的數(shù)據(jù)可知，臭靈丹丙酮提取物在一定的濃度范圍內(nèi)與清除率呈一定的線性關(guān)系，不同地區(qū)臭靈丹樣品丙酮提取物抗氧化能力依次為C10>C4>C9>C6>C3>C5>C13>C2>C1>C12>C7>C8>C11。

通過(guò)試驗(yàn)，得出蘆丁、沒(méi)食子酸、咖啡酸、香草酸和對(duì)香豆酸溶液的IC50分別為0.004 3 mg/mL、0.000 92 mg/mL、0.003 3 mg/mL、0.547 1 mg/mL和2.27 mg/mL，幾種標(biāo)準(zhǔn)品抗氧化能力順序?yàn)閷?duì)香豆酸<香草酸<蘆丁<咖啡酸<沒(méi)食子酸。

表4 臭靈丹丙酮提取物清除DPPH的回歸方程 及IC50值

Table 4 Regression equations and IC50value of DPPH scavenging rate of acetone extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

樣品Samples回歸方程RegressionequationR2IC50/(mg/mL)C1y=22.711x+6.64950.98151.9089C2y=29.129x+2.72680.96601.6229C3y=38.365x+3.09410.99551.2223C4y=74.845x+6.31160.99330.5837C5y=30.074x+5.6430.99061.4749C6y=40.939x+5.71720.99211.0817C7y=15.938x+4.7410.99062.8397C8y=13.637x+6.25670.99313.3188C9y=46.951x+1.9220.99451.0240C10y=100.91x+4.59740.9920.4499C11y=8.1013x+10.1450.99134.9195C12y=15.175x+14.9690.98352.3085C13y=27.776x+8.40610.99071.4975

圖4 不同地區(qū)臭靈丹樣品不同提取物清除DPPH的IC50

Fig.4 IC50of DPPH scavenging rate of different extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

2.3 不同地區(qū)臭靈丹樣品不同提取物清除DPPH自由基活性比較

從圖4可知，13個(gè)不同地區(qū)臭靈丹樣品乙醇、甲醇、丙酮提取物清除DPPH自由基活性的能力依次為甲醇提取物>乙醇提取物>丙酮提取物，說(shuō)明甲醇提取物中的抗氧化成分優(yōu)于乙醇提取物和丙酮提取物。

3 結(jié)論

1) 以超聲提取為提取方法，乙醇、甲醇、丙酮為溶劑制備云南省13個(gè)不同地區(qū)臭靈丹提取物，并測(cè)定其清除DPPH自由基的活性能力。結(jié)果表明，不同地區(qū)臭靈丹樣品的乙醇、甲醇、丙酮提取物抗氧化能力有一定的差異，其中C10樣品即楚雄雙柏產(chǎn)臭靈丹活性最強(qiáng)，C4樣品玉溪產(chǎn)臭靈丹次之，這可能是由于每個(gè)地方的臭靈丹生長(zhǎng)的環(huán)境差異(海拔、土壤、氣候、降雨量等)導(dǎo)致，環(huán)境不一樣臭靈丹中抗氧化物質(zhì)的含量及種類(lèi)存在差異，從而導(dǎo)致各地方不同的溶劑提取物之間出現(xiàn)顯著差異。

2) 云南省13個(gè)不同地區(qū)臭靈丹樣品乙醇、甲醇、丙酮提取物清除DPPH自由基活性的能力依次為甲醇提取物>乙醇提取物>丙酮提取物，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是甲醇提取物中含有大量的黃酮類(lèi)化合物及抗氧化活性物質(zhì)，致使甲醇提取物的抗氧化活性最強(qiáng)。如果要分離抗氧化活性物質(zhì)及開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑，建議首選甲醇提取物。

3) 根據(jù)幾種標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化能力，云南省13個(gè)地區(qū)甲醇提取物抗氧化能力(除樣品11)均大于標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)香豆酸，香草酸；樣品C2、C3、C4、C5、C6、C9、C10、C13乙醇提取物抗氧化能力均大于香草酸、對(duì)香豆酸，丙酮提取物抗氧化能力(除樣品11、12外)均大于香草酸，總體上，丙酮提取物抗氧化能力較弱。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

A scavenging Antioxidant Activity ofLaggerapterodontaExtracts from Different regions in Yunnan

HAO Zhiyun, YANG Xinzhou, LIN Huikun, GAO Yangqiu

(DepartmentofScienceandEngineering,DehongTeachers’College,Dehong,Yunnan678400,China)

The scavenging DPPH free radical capacity of different extracts from 13 Laggera pterodonta samples by three different extracting solvents of alcohol, methanol and acetone was analyzed and the antioxidant activity of Laggera pterodonta extracts was compared with other antioxidants to utilize Laggera pterodonta comprehensively. IC50of C1～C13 methanol extracts is 0.175 3 mg/mL, 0.195 3 mg/mL, 0.099 40 mg/mL, 0.084 74 mg/mL, 0.110 7 mg/mL, 0.124 6 mg/mL, 0.504 6 mg/mL, 0.291 5 mg/mL, 0.118 1 mg/mL, 0.056 35 mg/mL, 1.020 mg/mL, 0.213 3 mg/mL and 0.151 9 mg/mL respectively. IC50of C1～C13 alcohol extracts is 0.652 8 mg/mL, 0.463 7 mg/mL, 0.209 5 mg/mL, 0.225 8 mg/mL, 0.354 7 mg/mL, 0.395 7 mg/mL, 0.849 2 mg/mL, 0.852 0 mg/mL, 0.358 5 mg/mL, 0.143 6 mg/mL, 2.580 6 mg/mL, 0.724 2 mg/mL and 0.455 6 mg/mL separately. IC50of C1～C13 acetone extracts is 1.908 9 mg/mL, 1.622 9 mg/mL, 1.222 3 mg/mL, 0.583 7 mg/mL, 1.474 9 mg/mL, 1.081 7 mg/mL, 2.839 7 mg/mL, 3.318 8 mg/mL, 1.024 0 mg/mL, 0.449 9 mg/mL, 4.919 5 mg/mL, 2.308 5 mg/mL and 1.497 5 mg/mL respectively. IC50of rutin, gallic acid, caffeic acid, vanillic acid and p-coumaric acid (five standards) is 0.004 3 mg/mL, 0.000 92 mg/mL, 0.003 3 mg/mL, 0.547 1 mg/mL and 2.27 mg/mL separately. The antioxidant capacity of five standards and three extracts is gallic acid>caffeic acid >rutin>methanol extract>alcohol extract>acetone extract. The antioxidant capacity of 13 methanol extracts is higher than vanillic acid and p-coumaric acid. The antioxidant capacity of C2, C3, C4, C5, C6, C9, C10 and C13 alcohol extracts is higher than vanillic acid and p-coumaric acid.The antioxidant capacity of 10 acetone extracts is higher than vanillic acid.

Laggera pterodonta; antioxidant activity; DPPH free radical; antioxidant; Yunnan

2014-09-10； 2015-04-29修回

德宏師范高等專(zhuān)科學(xué)校校級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目“臭靈丹紅外指紋圖譜及抗氧化活性研究”(DSK201404)

郝志云(1960-)，男，副教授，從事分析化學(xué)及化學(xué)的教學(xué)與研究。 E-mail: YXZ1149@126.com

1001-3601(2015)05-0238-0065-04

R285.5

A