韓 雪， 吳松成， 朱麗莉， 陶宇航

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所， 貴州 貴陽 550005)

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貴州瑤山雞線粒體DNA D-loop區(qū)序列的多態(tài)性

韓 雪， 吳松成， 朱麗莉， 陶宇航

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所， 貴州 貴陽 550005)

為從母系遺傳角度探明貴州瑤山雞的群體遺傳背景，采用PCR產(chǎn)物直接測序技術對124只貴州瑤山雞樣品的線粒體DNA控制區(qū)(mtDNA D-loop)第Ⅰ高變區(qū)序列進行分析。結果表明：所分析的D-loop區(qū)部分序列(570 bp)中，A、G、C、T核苷酸平均含量分別為30.1%、13.5%、29.5%和26.9%；有26個核苷酸多態(tài)位點，其中轉換位點24個，顛換位點1個，轉換和顛換同時存在位點1個；核苷酸多樣度(Pi)平均為0.013 5；核苷酸平均差異數(shù)(k)為6.457；單倍型21種，多樣度(Hd)平均為0.793。通過群體構建的NJ聚類圖分子系統(tǒng)樹發(fā)現(xiàn)，貴州瑤山雞起源于紅原雞。

貴州瑤山雞； 線粒體DNA D-loop； 遺傳多樣性； 單倍型

線粒體DNA(mtDNA)呈共價閉合的環(huán)狀分子，序列長度約16 kbp，其中，D-Loop區(qū)屬于高度變異的非編碼區(qū)，可分為高變Ⅰ區(qū)(1～316 bp)、中間保守Ⅱ區(qū)(317～784 bp)和保守序列Ⅲ區(qū)(785～1 157 bp)[1]。由于mtDNA具有結構簡單、嚴格母系遺傳、進化速率快等特點，線粒體是細胞中重要的核外遺傳信息載體，遵循嚴格的母性遺傳方式。其已成為近年來研究動物遺傳進化的最佳手段之一。

貴州瑤山雞主產(chǎn)于荔波縣西南部的瑤山瑤族鄉(xiāng)，是經(jīng)過瑤族群眾獨特的養(yǎng)殖習俗和管理方式逐步形成的優(yōu)良地方品種，是寶貴的地方雞資源。其體型緊湊，具有生長快、飼料轉化率高、抗逆性強、耐粗放、適應性強等優(yōu)點，有很好的經(jīng)濟價值和開發(fā)利用價值。廖正錄等[2]對貴州瑤山雞品種資源進行了調查，安軍等[3]介紹了貴州瑤山雞育雛期的飼養(yǎng)管理及林下散養(yǎng)技術，唐繼高等[4]測定了貴州瑤山雞的肌肉常規(guī)成分與氨基酸含量，朱麗莉等[5]對貴州瑤山雞的生產(chǎn)性能進行了研究。但到目前為止未見對其種質遺傳特性的研究報道。為此，筆者采用mtDNA D-Loop區(qū)進行遺傳結構分析，為從母系遺傳角度探明貴州瑤山雞的群體遺傳背景。

1 材料與方法

1.1 貴州瑤山雞及DNA提取

供試貴州瑤山雞124只，隨機選自貴州省荔波縣瑤族鄉(xiāng)貴州瑤山雞養(yǎng)殖場，每只雞翅靜脈采血3 mL，EDTA抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎醚夯蚪MDNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。

1.2 PCR擴增及測序

引物序列為L16750：5′-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3′，H547：5′-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3′[6]。

PCR擴增反應體系：DNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mastermix(北京天根生化科技有限公司)7 μL，最后加ddH2O至20 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物回收與測序由北京鼎國生物技術有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所測DNA序列用DNASTAR 5.0軟件包進行拼接，用ClustalX 1.83進行多重比對[7]，然后用DnaSP 5.10軟件分析序列多態(tài)性[8]。從GenBank獲得紅原雞(NC-001323)、綠色原雞(NC-007238)、灰原雞(NC-007240)、錫蘭原雞(NC-0072389)以及紅原雞3個亞種爪哇紅原雞(NC-007236)、錫蘭紅原雞(NV-007235)、交趾雞(NC-007237)等mtDNAD-loop區(qū)序列，利用軟件MEGA 4.0[9]構建貴州瑤山雞NJ系統(tǒng)樹，同時構建MP樹和UPGMA樹。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物檢測

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測，所得條帶與目的片段大小一致(圖1)，且無雜帶，表明引物特異性較高。

注：M為2 000 bpMarker，1為空白對照，2～10為不同的樣品的PCR擴增條帶。

Note：M, 2000bp marker; 1, CK; 2～10, PCR amplification of different samples.

圖1 PCR擴增電泳圖譜

Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification

2.2 堿基組成

貴州瑤山雞mtDNA D-Loop核苷酸序列中A、C、G、T核苷酸的平均比例分別為30.1%、13.5%、29.5%和26.9%。A+T含量為57%，G+C含量為43%，說明貴州瑤山雞線粒體DNA D-loop區(qū)部分序列富含A+T；表現(xiàn)出堿基組成的偏倚性。

2.3 遺傳多態(tài)性

貴州瑤山雞mtDNA D-loop區(qū)部分序列大小為570 bp，包括高變Ⅰ區(qū)和部分保守Ⅱ區(qū)。以其中任一單倍型h1作為標準進行比較分析，確定21種單倍型(表)，其中h12單倍型個體數(shù)最多。共有26個變異位點，約占分析位點總數(shù)的4.56%，其中單一多態(tài)位點5個，分別在98 bp、138 bp、167 bp、229 bp和235 bp處；簡約信息位點21個，分別在91 bp、170 bp、174 bp、195 bp、215 bp、222 bp、227 bp、241 bp、256 bp、276 bp、281 bp、291 bp、294 bp、295 bp、298 bp、312 bp、320 bp、325 bp、330 bp、338 bp和370 bp處。

26個變異位點堿基發(fā)生轉換的有24個，占92.3%；發(fā)生顛換的有1個，占3.85%；轉換和顛換同時存在的有1個，占3.85%。核苷酸多樣度(Pi)平均為0.0135，核苷酸平均差異數(shù)(k)為6.457，單倍型多樣度(Hd)平均為0.793。

2.4 系統(tǒng)樹

NJ系統(tǒng)樹、MP樹和UPGMA樹的拓撲結構一致。從圖2看出，貴州瑤山雞21種單倍型的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)聚為3個分支。紅原雞(NC-001323)、錫蘭紅原雞(NV-007235)、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17和h18聚為第1個分支；爪哇紅原雞(NC-007236)、交趾雞(NC-007237)、h3、h4、h5、h12、h19、h20、h21聚為第2個分支；h6和h7聚為第3個分支。

表 貴州瑤山雞種群體mtDNA D-loop區(qū) 單倍型及其變異位點

Table Haplotypes and their variation loci of mt DNA D-loop region in Guizhou Yaoshan Chicken population

單倍型Haplotypes變異位點Variationloci數(shù)量/只Quantity比例%Proportion[111112222222222222333333][99367791222345789999122337][18870455279516611458205080]h1AGCAAGTAGAGGGTAGGGCTGGCTGA129.677419h2.................C........10.806452h3........................A.1814.516130h4..............G.........A.10.806452h5..............G.......T.A.10.806452h6.......GA..AT........AT.A.10.806452h7.......GA...T........AT.A.10.806452h8G........G....GA.A..AA..AG64.838710h9G........G....GA.A.CAA..AG43.225806h10G........G....GA.A..AA.CAG10.806452h11G........G....GA.A..AA..A.10.806452h12G.......AG....GAAA...AT.A.4838.709680h13G.......AGA...GAAA...AT.A.10.806452h14G.T.....AG....GAAA...AT.A.10.806452h15G..G....AG....GAAA...AT.A.10.806452h16G.......AG....GAAA.C.AT.A.10.806452h17G.......AG....GAAA...ATCA.10.806452h18G.............GA.A...AT.A.10.806452h19G...GAC......CG...T..A..A.2116.935480h20GA..GAC......CG...T..A..A.10.806452h21G.............G......A..A.10.806452

圖2 貴州瑤山雞mtDNA D-loop區(qū) 序列單倍型的NJ系統(tǒng)樹

Fig.2 NJ phylogenetic tree of mtDNA D-loop region in Guizhou Yaoshan Chicken

3 結論與討論

傅衍等[6]在仙居雞、靈昆雞、來航雞、白銀耳雞、蕭山雞、白羽烏骨雞的D-loop第一高變區(qū)相同序列只檢測到24個變異位點，序列變異率為4.45%，單倍型數(shù)為13種。蔣利等[10]在瀘寧雞、米易雞、草科雞的D-loop區(qū)相同序列中只檢測到30個變異位點，序列變異率為5.09%，單倍型數(shù)為19種。試驗結果表明，貴州瑤山雞mtDNA D-loop區(qū)部分序列全長為570 bp，有26個突變位點，約占核苷酸總數(shù)的4.56%，有21種單倍型數(shù)。對于核酸序列來說，核苷酸多樣度是衡量群體遺傳變異程度的重要指標，核苷酸多樣度越大，群體遺傳變異程度越高[11]。貴州瑤山雞的平均核苷酸多樣度為0.013 5，與傅衍等[6]和蔣利等[10]的研究相比，平均核苷酸多樣度核處于較高位置，說明該群體的遺傳變異程度較高，遺傳多樣性較為豐富。一般認為，分歧時間越長、親緣關系越遠的分類單元之間，核苷酸發(fā)生顛換的頻率越高。貴州瑤山雞mtDNA D-loop區(qū)部分序列中核苷酸出現(xiàn)轉換24個、顛換1個，轉換和顛換在同一位點1個，轉換出現(xiàn)的頻率明顯高于顛換，表明貴州瑤山雞群體內出現(xiàn)的分歧時間并不長，親緣關系比較近，與實際情況相符。

貴州瑤山雞所有單倍型個體與紅原雞及紅原雞的3個亞型聚在一個大分支上，表明貴州瑤山雞起源于紅原雞，并有多個母系起源。

[1] Randi E，Lucchini V.Organization and evolution of the mi tochondrial DNA control region in the avian genus Alectoris[J].J Mol Evol，1998，47(4):44-46.

[2] 廖正錄，韋 駿，羅 俊.貴州瑤山雞品種資源調查報告[J].貴州畜牧獸醫(yī)，1998(2)：12-13.

[3] 安 軍，劉 蘭，覃若萍.淺談貴州瑤山雞育雛期的飼養(yǎng)管理及林下散養(yǎng)技術[J].農技服務，2008(4):72-72.

[4] 唐繼高，吳松成，黃 波，等.貴州瑤山雞的肌肉常規(guī)成分與氨基酸含量測定[J].貴州農業(yè)科學，2013，41(10):121-123.

[5] 唐繼高，朱麗莉，吳松成，等.貴州瑤山雞的生產(chǎn)性能研究[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014(6)：70-71.

[6] 傅 衍，牛 冬，阮 暉，等.浙江省地方雞種的遺傳多樣性的研究[J].遺傳學報，2001，28(7):606-613.

[7] Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The Clustal Xwindows interface flexible strategies for multiplesequencealignment aided by quality analysis tool[J].Nucleic Acid Research，1997，24:4876-4882.

[8] Roza S J，Sanchez-delbarrio J C，Messeguer X，et a1.DnaSP: DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J].Bioinformatics，2003，19(18):2496-2497.

[9] Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28(10):2731-2739.

[10] 蔣 利，蔣小松，熊 斌，等.基于D-loop區(qū)序列分析的四川省三個地方雞種遺傳多樣性及母系親緣關系研究[J].中國家禽，2013，35(18):10-14.

[11] Lima -Rosa C A V，Canal C W，Streck A F，et al.B-FDNA sequence variablitiy in Brazilian (blue -egg Caipira)chickens[J].Anim Genet，2004，35:278-284.

(責任編輯： 馮 衛(wèi))

Polymorphism of mtDNA D-loop Region in Guizhou Yaoshan Chicken

HAN Xue, WU Songcheng, ZHU Lili, TAO Yuhang

(GuizhouInstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,Guiyang,Guizhou550005,China)

The sequence of mtDNA D-loop I hypervariable region of 124 Guizhou Yaoshan Chicken was analyzed by using PCR product sequencing to explore the population genetic background of Guizhou Yaoshan Chicken from the angle of matrilineal inheritance. Results:The average content of A, G, C and T nucleotides in partial sequence (570 bp) of the analyzed D-loop region is 30.1%, 13.5%, 29.5% and 26.9% respectively.There are 26 nucleotide polymorphic loci including 24 transition loci, 1 transvertion locus and 1 locus with transition and transvertion. Average nucleotide diversity (Pi) is 0.013 5. Average nucleotide difference (k) is 6.457. 21 haplotypes are identified and the average diversity (Hd) is 0.793. Guizhou Yaoshan Chicken is originated from Red Jungle Fowl.

Guizhou Yaoshan Chicken; mitDNA D-Loop region; genetic diversity; haplotype

2014-12-28； 2015-06-17修回

貴州省農業(yè)科學院基金項目“貴州瑤山雞的純繁選育研究”[黔農科(基金)2011007]；貴陽市科技局項目“省級農業(yè)科技示范園區(qū)——貴州瑤山雞高產(chǎn)種群純繁技術研究與示范推廣”[筑科合同(2013102)1-2-1]

韓 雪(1982-)，女，助理研究員，碩士，從事動物遺傳育種工作。E-mail：hanxue8855601@126.com

1001-3601(2015)07-0352-0023-03

S831.2

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