李德海， 史錦碩， 周 聰， 孫宏偉， 王振宇

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

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黑木耳多糖的制備及其抗凝血功能的研究

李德海1， 史錦碩1， 周 聰1， 孫宏偉1， 王振宇2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

[目的] 探討黑木耳多糖的制備并研究其抗凝血功能。[方法] 采用水、酸溶液及堿溶液對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行提取制備，并以APTT、PT、TT 3個(gè)體外抗凝血指標(biāo)為衡量依據(jù)，分別對(duì)其抗凝血功能進(jìn)行了研究。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，水溶性黑木耳多糖的提取率最高，而堿溶性多糖的純度最高，且除蛋白后多糖純度高于除蛋白前，可達(dá)到83.05%。抗凝血試驗(yàn)表明，水溶性、酸溶性和堿溶性3種黑木耳多糖均能顯著延長(zhǎng)家兔血漿的APTT(P<0.01)，而對(duì)PT和TT無(wú)明顯影響(P>0.01)，并且APTT的值與多糖濃度呈正相關(guān)。多糖對(duì)APTT的作用強(qiáng)弱順序?yàn)閴A溶性>水溶性>酸溶性，且除蛋白后的多糖對(duì)APTT的作用效果均高于除蛋白前。[結(jié)論] 研究可為黑木耳多糖在抗凝血臨床方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

黑木耳多糖；制備；抗凝血

黑木耳又名叫木耳、云耳等，是一種非常珍貴的并且具有食用價(jià)值和藥用價(jià)值的膠質(zhì)真菌[1]，主要生長(zhǎng)在我國(guó)的東北三省以及湖北、福建、四川、廣東、山東、貴州、云南等省份。在藥用價(jià)值方面，我國(guó)醫(yī)學(xué)歷來(lái)認(rèn)為黑木耳也是一種藥用價(jià)值較高的藥用菌，也是目前公認(rèn)的可食性保健品，其子實(shí)體具有清肺益氣、滋潤(rùn)補(bǔ)血、止痛鎮(zhèn)定、活血化瘀的功效，也被用于治療血管硬化、高血壓、子宮出血、便秘等。研究表明，黑木耳多糖還具有抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、降血糖[6]、降血脂[5]等作用。目前已有一些報(bào)告證明其確實(shí)具有抗凝血功效，筆者以APTT、PT、TT 3個(gè)體外抗凝血指標(biāo)為衡量依據(jù)，分別測(cè)定酸溶液、堿溶液和蒸餾水提取的黑木耳多糖的抗凝血功效，并討論除蛋白對(duì)該生理功效的影響，從而篩選出抗凝血效果最好的一種黑木耳多糖，為黑木耳多糖在抗凝血臨床方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料天然野生黑木耳由黑龍江省大興安嶺興安有機(jī)食品有限公司提供。試驗(yàn)中所用試劑均為分析純。肝素鈉由solarbio公司提供，效價(jià)≥140 U/mg；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定試劑盒(白陶土，凝固法)、凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定試劑盒(凍干型，凝固法)、凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定試劑盒(凝固法)由上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司提供。

TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722s分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；JA2003分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器公司；Finnpipette移液槍，美國(guó)Thermo Lab-system公司；FM-100粉碎機(jī)，日本1watani公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1黑木耳多糖的提取及制備。將市購(gòu)的黑木耳除雜、粉碎，過(guò)60目篩，用3倍體積的石油醚浸泡24 h進(jìn)行脫脂處理。

準(zhǔn)確稱取脫脂后的黑木耳干粉，分別按料液比1∶100 g/ml加入蒸餾水、0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液后，于90 ℃的水浴中浸提4 h，提取液以4 000 r/ min離心10 min。然后采用H2O2脫色法對(duì)得到的黑木耳多糖進(jìn)行脫色處理，測(cè)定并記錄其多糖含量。

將得到的3種黑木耳多糖溶液分別分為2份，一份經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮后采用糖液3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，過(guò)濾，冷凍干燥成粉，用于不除蛋白的活性研究；另一份采用Sevage法除蛋白后，將得到的上清液旋轉(zhuǎn)濃縮后同樣采用糖液3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，過(guò)濾，冷凍干燥成粉，用于除蛋白后的活性研究。

1.2.2多糖含量的測(cè)定。該試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用分析天平準(zhǔn)確稱取40 mg經(jīng)干燥恒重的葡萄糖粉末，用蒸餾水溶解并定容至500 ml容量瓶中。然后準(zhǔn)確吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再補(bǔ)加蒸餾水至2.0 ml。以蒸餾水做空白對(duì)照。分別加入1.0 ml的6%的苯酚溶液和5.0 ml的濃硫酸溶液，靜止10 min，搖勻。再在室溫條件下放置20 min。然后在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)?；貧w方程：Y=-0.001 8+0.011 2X。

1.2.2.2多糖含量的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取2.0 ml多糖溶液，然后加入1.0 ml的6%的苯酚溶液和5.0 ml的濃硫酸溶液，靜止10 min，搖勻。再在室溫條件下放置20 min。然后在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光值，按下面的公式可計(jì)算出溶液中的多糖含量。

式中，V為所測(cè)溶液體積(ml)；Y為吸光值。

1.2.3黑木耳多糖抗凝血作用的評(píng)價(jià)。以活化部分凝血活

酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)3個(gè)體外抗凝血指標(biāo)作為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)不同溶液提取所獲多糖的抗凝血效果進(jìn)行研究。動(dòng)物混合血漿的制備：選擇成年健康家兔，心臟取血，用 0.109 mol/L 檸檬酸鈉抗凝(體積比10∶1)，3 000 r/min 離心15 min，取上清血漿備用。分別準(zhǔn)確吸取6種不同的黑木耳多糖樣品與已制備好的成年家兔血漿以1∶4的體積比混勻成待測(cè)血漿，然后以等量的0.002 6 mg/ml肝素鈉代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照組，以等量的生理鹽水(0.9%)代替待測(cè)樣品作為陰性對(duì)照組。APTT、PT、TT 3個(gè)指標(biāo)的測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶液浸提黑木耳多糖得率的比較分別用蒸餾水、酸溶液、堿溶液提取黑木耳多糖，并分別設(shè)除蛋白前組及除蛋白后組，測(cè)定幾種多糖的得率及多糖純度結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶液對(duì)黑木耳多糖提取影響的比較 %

由表1可知，水溶性黑木耳多糖得率最高，堿溶性次之，酸溶性最低，其得率分別為18.55%、15.34%、10.38%。而多糖純度由大到小依次為：堿溶性黑木耳多糖、水溶性黑木耳多糖、酸溶性黑木耳多糖，且除蛋白后多糖純度高于除蛋白前。

2.2 不同溶液提取黑木耳多糖抗凝血的分析

2.2.1黑木耳多糖抗凝血功能性的研究。配制10 mg/ml的多糖溶液進(jìn)行黑木耳多糖抗凝血功能的初步研究。家兔血漿中分別加入6種黑木耳多糖后，3項(xiàng)凝血指標(biāo)(APTT、PT、TT)的測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 黑木耳多糖抗凝血研究

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(其中n=3)，試驗(yàn)組數(shù)均為3；與陰性對(duì)照組相比較，**表示P<0.01。

由表2可以看出，與生理鹽水陰性對(duì)照組相比，6種黑木耳多糖對(duì)APTT有顯著的延長(zhǎng)作用(P<0.01)，而對(duì)PT及TT均無(wú)明顯作用(P>0.01)。醫(yī)學(xué)上根據(jù)凝血現(xiàn)象的觸發(fā)機(jī)理的不同，將凝血過(guò)程劃分為外源性凝血機(jī)制和內(nèi)源性凝血機(jī)制。APTT、TT和PT是各自獨(dú)立的基礎(chǔ)性凝血途徑篩查指標(biāo)，APTT反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的活性，PT反映外源性凝血途徑的指標(biāo)[7]。分析該試驗(yàn)結(jié)果表明，黑木耳多糖主要通過(guò)內(nèi)源性凝血機(jī)制發(fā)揮其抗凝血作用。這與申建和等在黑木耳多糖、銀耳多糖、銀耳孢子多糖的抗凝血作用中的體內(nèi)抗凝血試驗(yàn)研究結(jié)果相一致，主要差別在于該試驗(yàn)研究的是黑木耳多糖的體外抗凝血[8]。故后續(xù)試驗(yàn)選取APTT作為抗凝血檢測(cè)指標(biāo)。

2.2.2不同濃度水溶性黑木耳多糖對(duì)兔血漿APTT的影響。分別選取2、6、10 mg/ml 3個(gè)濃度梯度的水溶性黑木耳多糖溶液與兔血漿混合，測(cè)定其APTT的值，并對(duì)比除蛋白處理對(duì)APTT的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 水溶性黑木耳多糖對(duì)APTT的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(其中n=3)，試驗(yàn)組數(shù)均為3。

由表3可以看出，與陰性對(duì)照組相比，3種濃度的水溶性黑木耳多糖對(duì)兔血漿的APTT值均有顯著延長(zhǎng)效果(P<0.01)，但其APTT值仍均低于陽(yáng)性對(duì)照組。同時(shí)可以看出，兔血漿的APTT值隨水溶性黑木耳多糖濃度的增大而增大，并且經(jīng)過(guò)除蛋白處理的多糖其兔血漿的APTT值高于同濃度未除蛋白的多糖。

2.2.3不同濃度酸溶性黑木耳多糖對(duì)兔血漿APTT的影響。分別選取2、6、10 mg/ml 3個(gè)濃度梯度的酸溶性黑木耳多糖溶液與兔血漿混合，測(cè)定血漿的APTT值，對(duì)比多糖除蛋白前后對(duì)APTT的影響，結(jié)果如表4所示。

表4 酸溶性黑木耳多糖抗凝血作用分析

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(其中n=3)，試驗(yàn)組數(shù)均為3組。

由表4可以看出，與陰性對(duì)照組相比，除2 mg/ml未除蛋白的酸溶性黑木耳多糖的血漿APTT沒(méi)有顯著延長(zhǎng)(P>0.05)以外，其他較高濃度及2 mg/ml的除蛋白后的酸溶性多糖均可以顯著延長(zhǎng)血漿的APTT(P<0.01)。但該試驗(yàn)3種濃度的酸溶性多糖的血漿APTT值均小于陽(yáng)性對(duì)照組。從表4中還可看出，APTT的值與多糖濃度呈正相關(guān)。并且加入除蛋白后多糖的血漿APTT值均高于加入同濃度未除蛋白多糖的。

2.2.4不同濃度堿溶性黑木耳多糖對(duì)兔血漿APTT的影響。同樣選取2、6、10 mg/ml 3個(gè)濃度梯度的堿溶性黑木耳多糖溶液與兔血漿混合，測(cè)定血漿的APTT值，并對(duì)比多糖除蛋白前后對(duì)APTT的影響，結(jié)果如表5所示。

表5 堿溶性黑木耳多糖抗凝血作用分析

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(其中n=3)，試驗(yàn)組數(shù)均為3組。

由表5可以看出，相比于陰性對(duì)照組，3種不同濃度的堿溶性黑木耳多糖均可以顯著延長(zhǎng)血漿的APTT(P<0.01)，尤其是10 mg/ml除蛋白后的堿溶性黑木耳多糖，使血漿的APTT延長(zhǎng)至陰性對(duì)照組的4倍左右，已與0.002 6 mg/ml的肝素鈉陽(yáng)性對(duì)照組取得了相當(dāng)?shù)目鼓Ч?。并且從?shù)據(jù)中可以看出，APTT隨多糖濃度的增大而延長(zhǎng)。對(duì)于經(jīng)過(guò)除蛋白處理的堿溶性多糖，濃度為10 mg/ml時(shí)血漿的APTT比濃度為2 mg/ml時(shí)延長(zhǎng)了近2倍。同時(shí)可看出，除過(guò)蛋白的多糖其血漿的APTT值大于同濃度未除蛋白多糖的。

綜合表3、4、5可以看出，水溶性、酸溶性和堿溶性黑木耳多糖相比于陰性對(duì)照組，均使血漿的APTT顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。并且在試驗(yàn)范圍內(nèi)，APTT的值與多糖濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明黑木耳多糖的抗凝血功效在一定范圍內(nèi)有一定的劑量依賴性，這與王辰龍等的研究結(jié)果相一致[9]。其中堿溶性黑木耳多糖對(duì)APTT的延長(zhǎng)效果最明顯，其次為水溶性黑木耳多糖，酸溶性黑木耳多糖最弱；而對(duì)于同一種溶液提取的黑木耳多糖來(lái)說(shuō)，其除蛋白前后對(duì)APTT的延長(zhǎng)效果也有顯著差別，除蛋白后的多糖對(duì)APTT的延長(zhǎng)效果均高于除蛋白前。推測(cè)可能是由于除蛋白時(shí)除去了黑木耳粗多糖中游離的蛋白質(zhì)，使其單位作用面積上的多糖濃度大大提高，因此使得其抗凝血效果得到了顯著性的增加。

3 結(jié)論

3.1 黑木耳多糖的提取黑木耳多糖經(jīng)不同pH的溶液提取，其提取率存在著明顯的差異性。其中水溶性黑木耳多糖的提取率最高，約為18.55%，其次為堿溶性黑木耳多糖15.34%，酸溶性黑木耳多糖最低，約為10.38%；多糖含量關(guān)系為：堿溶性>水溶性>酸溶性，且除蛋白后多糖含量高于除蛋白前。

3.2 黑木耳多糖的抗凝血性該試驗(yàn)提取得到的水溶性、酸溶性和堿溶性黑木耳多糖相比于陰性對(duì)照均對(duì)APTT有明顯的延長(zhǎng)效果，并且這種效果在一定范圍內(nèi)有一定的劑量依賴性，而對(duì)PT和TT值無(wú)明顯影響。不同溶液提取的黑木耳多糖對(duì)APTT的延長(zhǎng)效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋簤A溶性>水溶性>酸溶性；并且除蛋白處理可以在一定程度上提高其該功效。因此綜合多糖提取率和含量考慮可得出，經(jīng)除蛋白處理的堿溶性黑木耳多糖最適合作為一種天然抗凝血活性成分進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

以上結(jié)論為黑木耳多糖在抗凝血方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，其具體抗凝血機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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Preparation of Polysaccharides fromAuriculariaauricularand Analysis of Their Anticoagulant Function

LI De-hai1, SHI Jin-shuo1, ZHOU Cong1, WANG Zhen-yu2*et al

(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. College of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150086)

[Objective] To discuss the preparation of polysaccharides fromAuriculariaauricular, and study its anticoagulant function. [Method] Water, acid solution and alkaline solution were used to extract the polysaccharides fromAuriculariaauricular. With APTT, PT, TT as basis, its anti-clotting function was studied. [Result] The results showed that the water-soluble polysaccharides fromAuriculariaauricularhad the highest extraction rate, while the alkali-soluble polysaccharide had the highest purity, and the purity of the polysaccharide which had protein removed was higher than those hadn’t, reaching 83.05%. The results showed that three kinds of polysaccharides fromAuriculariaauricularcan significantly prolong rabbits plasma APTT (P<0.01), whereas no significant effect on PT or TT (P>0.01). The value of APTT and polysaccharide concentrations were positively correlated. The order of the effect which Polysaccharides took on APTT was alkali-soluble> water-soluble> acid soluble. In addition, removal of protein can increase the effect on APTT. [Conclusion] The study can provide reference basis for application ofAuriculariaauricularpolysaccharides in anticoagulant.

Polysaccharides fromAuriculariaauricular; Preparation;Anticoagulant

黑木耳即食產(chǎn)品開(kāi)發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究項(xiàng)目(GA13B202)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014CA19)。

李德海 (1976- )，男，山東茌平人，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事食品化學(xué)及植物有效成分研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物分離與功能性食品開(kāi)發(fā)研究。

2014-11-24

S 646.6

A

0517-6611(2015)02-283-03