曉 華，張思遠，海 平，李久明，徐 寧

(內(nèi)蒙古民族大學，內(nèi)蒙古通遼 028000)

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草烏中二萜生物堿的提取工藝及化學成分研究

曉 華，張思遠，海 平，李久明，徐 寧*

(內(nèi)蒙古民族大學，內(nèi)蒙古通遼 028000)

[目的]優(yōu)化草烏中二萜生物堿的提取工藝，為草烏的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。[方法]采用超聲波輔助法從草烏中提取二萜生物堿，以烏頭堿收率為指標，考察提取溶劑、提取時間及固液比對提取工藝進行優(yōu)化。[結(jié)果]最佳工藝為固液比1∶10、提取時間2 h、乙醇濃度75%；用HPLC-MS技術對草烏提取物進行成分鑒定，共鑒定8個二萜生物堿。[結(jié)論]應用超聲提取法從草烏中提取二萜生物堿簡單易行。

草烏；二萜生物堿；超聲提取；HPLC-MS；工藝優(yōu)化；化學成分

草烏為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥塊根，可以歸心、肝、脾經(jīng)和毒烈竄散，功可祛風除濕、溫經(jīng)散寒及消腫止痛，主治風寒濕痹、頭風頭痛、中風不遂、心腹冷痛、寒痛作痛、癖血痞塊、跌打損傷、陰疽腫毒、神經(jīng)痛、疔瘡等和頑癬等[1]。現(xiàn)代藥理研究表明二萜生物堿是草烏的有效成分，已發(fā)現(xiàn)生物堿有烏頭堿、中烏頭堿、新烏頭堿等[2-4]。

超聲波輔助提取是一種新型的提取技術，與傳統(tǒng)方法相比，它利用超聲波破壞植物的細胞，使提取時間縮短、提取效率高。目前，關于草烏的提取方法研究較少，多采用加熱回流法，該試驗對草烏中二萜生物堿提取工藝進行優(yōu)化，并用HPLC-MS技術對提取物中二萜生物堿進行成分鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原材料。草烏，產(chǎn)地為吉林。

1.1.2主要試劑。甲酸(色譜純，純美國Alfa Aesar公司)；甲醇(色譜純，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心)；乙腈(色譜純，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心)；乙醇(分析純，天津凱信化工有限公司)；蒸餾水(實驗室自制)。

1.1.3主要儀器。UHPLC(Waters公司)；Micromass ZQ20-00質(zhì)譜(Waters公司)；KH-3200B型超聲波清洗器(禾山超聲波儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1草烏中二萜生物堿的提取。準確稱取1.00 g草烏，用10 ml 75%乙醇超聲提取2次，每次2.0 h，過濾，濾液置于50 ml容量瓶中，用乙醇定容。

1.2.2提取工藝的考察。

1.2.2.1提取溶劑的考察。在超聲時間2 h、固液比1∶10的條件下，分別用65%、75%、85%、95%乙醇提取草烏中二萜生物堿，通過HPLC比較烏頭堿的峰面積，確定乙醇溶度。

1.2.2.2提取時間的考察。在提取溶劑75%乙醇、固液比1∶5的條件下，分別用提取時間1.0、1.5、2.0、2.5 h提取草烏中二萜生物堿，通過HPLC比較烏頭堿的峰面積，確定提取時間。

1.2.2.3固液比的考察。在超聲時間2.0 h、提取溶劑75%的條件下，分別用固液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20提取草烏中二萜生物堿，通過HPLC比較烏頭堿的峰面積，確定固液比。

1.2.3草烏中二萜生物堿的成分分析。

1.2.3.1HPLC條件。色譜條件為流動相0.2%甲酸水溶液(A，v/v)和乙腈(B)、檢測波長265 nm、流速2.0 ml/min、上樣量10 μl。洗滌梯度分別為0～5 min，2%～10%B；5～10 min，10%～18%B；10～22 min，18%～23%B；22～35 min，23%～40%B；35～55 min，40%～95%B；55～65 min，95%～95%B。

1.2.3.2MS條件。ESI正離子源模式，掃描范圍100～1500 m/z，霧化氣壓300 kPa，毛細管電壓3 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 草烏中二萜生物堿的提取工藝

2.1.1提取溶劑。從圖1可以看出，隨乙醇濃度增加，烏頭堿的含量先增加后降低，當提取溶劑為75%乙醇時，烏頭堿的含量最高。因此，選擇75%乙醇作為提取溶劑。

2.1.2提取時間。由圖2可見，當提取時間2.5 h，提取液中烏頭堿的含量明顯降低。這種現(xiàn)象的原因可能是烏頭堿發(fā)生水解反應，這與超聲波儀的功率、頻率有關。因此，選擇提取時間2.0 h。

2.1.3固液比。從圖3可知，當固液比從1∶5到1∶10時，烏頭堿得率上升趨勢明顯；但固液比從1∶10到1∶20時，烏頭堿得率變化不明顯。因此，最佳固液比為1∶10。

2.2 草烏中二萜生物堿的鑒定將草烏按“1.2.3”方法經(jīng)HPLC-MS檢測得到高效液相色譜圖和質(zhì)譜總離子流圖，從圖4可以看出，草烏提取物分別對離子檢測器和紫外吸收檢測器響應能力不同，說明色譜和質(zhì)譜能夠互相彌補各自的缺陷，得到更多的信息。

根據(jù)烏頭堿的保留時間和質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)，鑒定出保留時間19.2 min色譜峰為烏頭堿。同時根據(jù)樣品中化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，又推斷出8個二萜生物堿成分，它們可能是烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿、脫氧烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰脫氧烏頭堿和3-乙?；鶠躅^堿[5](表1)。除此之外，在總離子流圖(圖4b)中還發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比482、500、526、542、586、720、778和912準分子離子峰。其中，質(zhì)荷比482可能為乙酰別那寧型烏頭堿；質(zhì)荷比500、526、542、586為單酯型烏頭堿；質(zhì)荷比720、778為三酯型烏頭堿；質(zhì)荷比912以烏頭堿為母核、C-3為乙?；-8為脂肪?；娜バ椭惿飰A。

表1 草烏中二萜生物堿的質(zhì)譜歸屬

3 結(jié)論與討論

超聲波提取以其提取溫度低、提取率高、提取時間短的獨特優(yōu)勢，應用于中藥材有效成分的提取，是替代傳統(tǒng)工藝方法，實現(xiàn)高效、節(jié)能、環(huán)保式提取的現(xiàn)代高新技術手段。該試驗采用超聲波提取草烏中二萜生物堿，其最佳條件是固液比1∶10、超聲時間2.0 h、乙醇濃度75%。采用HPLC-MS技術，共鑒定出8種二萜生物堿，分別為烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿、脫氧烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰脫氧烏頭堿和3-乙酰基烏頭堿。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典:一部[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005.

[2] 李正邦,呂光華,陳東林,等.草烏中生物堿的化學研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997,9(1):9-13.

[3] 任玉林,黃兆宏,賈世山.蒙藥草烏花中的三酯型二萜生物堿的分離和鑒定[J].藥學學報,1999,34(11):873-876.

[4] 孟甄,丁怡,魯靜,等.生制烏頭總堿對心臟功能及其毒性的比較[J].中國藥理學通報,2004,20(7):801-803.

[5] 許慶軒，王勇，劉志強，等.草烏中二萜類生物堿的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究[J].高等學校化學學報，2005，26(4):638-641.

Study on Extracting Conditions of Norditerpenoid Alkaloids in Roots ofAconitumkusnezoffiiReichb and Chemical Composition

XIAO Hua, ZHANG Si-yuan, HAI Ping, XU Ning*et al

(Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028000)

[Objective] To optimize extraction technique for norditerpenoid alkaloids in roots ofAconitumkusnezoffii, and provide basis for quality control. [Method] The extraction of norditerpenoid alkaloids ofA.kusnezoffiiwith ultrasonic technology was conducted. Using the yield of aconitine as an index, the extracting technology was optimized on extractant, solid-liquid ratio and ultrasonic time. [Result] The optimal technique conditions are: solid-liquid ratio 1∶10, extraction time 2 h, ethanol concentration 75%. HPLC-MS technology was used to identify the composition ofA.kusnezoffiiextracts. 8 kinds of norditerpenoid alkaloids were obtained. [Conclusion] The optimum extraction method was rational, consistent and feasible.

AconitumkusnezoffiiReich; Norditerpenoid alkaloid; Ultrasonic technology; HPLC-MS; Technique optimization; Chemical composition

內(nèi)蒙古民族大學博士/碩士科研啟動基金(BS307)。

曉華(1983-)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古通遼人，助理實驗師，碩士，從事天然產(chǎn)物化學研究。*通訊作者，講師，博士，從事有機化學研究。

2014-11-28

S 567;O 629.9

A

0517-6611(2015)02-113-02