張 健， 李 鏘， 王倫興， 王召賀， 楊再昌,2*

(1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550025；

2.貴州大學(xué)藥學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

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細(xì)菌GYZC02株的鑒定及抗血栓的活性研究

張 健1， 李 鏘1， 王倫興1， 王召賀1， 楊再昌1,2*

(1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550025；

2.貴州大學(xué)藥學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

[目的]鑒定細(xì)菌GYZC02株，并研究其抗血栓活性。[方法]利用形態(tài)學(xué)特征、生化試驗(yàn)和16S rRNA 序列同源性比較鑒定菌株，通過(guò)小鼠斷尾試驗(yàn)和小鼠尾動(dòng)脈血栓模型驗(yàn)證GYZC02發(fā)酵液的抗血栓活性。[結(jié)果]根據(jù)形態(tài)學(xué)、生化試驗(yàn)和16S rDNA 序列測(cè)定結(jié)果，該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。通過(guò)灌胃給藥發(fā)現(xiàn)，GYZC02發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物能明顯延長(zhǎng)小鼠斷尾出血時(shí)間，抑制小鼠尾動(dòng)脈血栓的形成，表明該細(xì)菌具有抗血栓活性。[結(jié)論]枯草芽孢桿菌GYZC02發(fā)酵液的小分子物質(zhì)具有抗血栓活性。

GYZC02；鑒定；抗血栓活性

血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有大約1 500萬(wàn)人死于血栓栓塞性疾病，我國(guó)每年的發(fā)病人數(shù)約為1 000萬(wàn)，病死人數(shù)有100萬(wàn)，致殘率也很高[1-2]。血栓性疾病的藥物治療手段包括抗凝治療、抗血小板藥物治療和溶栓治療，但是現(xiàn)有藥物均存在各方面的問(wèn)題，如價(jià)格昂貴、不易保存、具有出血等副作用[3]，因此研發(fā)新型抗血栓藥物具有重要意義。迄今為止，關(guān)于細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物具有抗血栓活性的報(bào)道尚不多見(jiàn)。筆者一直致力于從微生物中發(fā)現(xiàn)抗血栓藥物，從土壤樣本中篩選到1株細(xì)菌，其發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物具有抗血栓活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株。GYZC02菌株分離自貴陽(yáng)市花溪區(qū)農(nóng)用地土壤。

1.1.2試劑。角叉菜膠購(gòu)自Sigma公司，尿激酶為南大藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3液體培養(yǎng)基。葡萄糖 15 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，Na2HPO33 g，CaCl20.06 g，MgSO40.3 g，純凈水1 000 ml,pH 7.0，121 ℃，滅菌20 min。

1.2 細(xì)菌鑒定

1.2.1生理生化特征。參照文獻(xiàn)[4-5]的方法進(jìn)行生理生化特征鑒定。

1.2.216S rRNA 基因序列分析。將斜面保藏的菌種活化，接種到種子液培養(yǎng)，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。擴(kuò)增采用的引物正向引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(27F),反向引物為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′(1492R)。PCR 反應(yīng)體系(20～50 ng/μl)：在94 ℃預(yù)變性4 min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段93 ℃變性45 s，57 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后在72 ℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收，并進(jìn)行序列測(cè)定。所測(cè)序列用Blast軟件與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,從而確定GYZC02菌株的同源性。

1.2.3細(xì)菌致病性試驗(yàn)。取細(xì)菌GYZC02株發(fā)酵液(1×108CFU/ml)0.5 ml，給8只健康小白鼠灌胃，同時(shí)用生理鹽水作為對(duì)照(n=8)，觀察15 d,記錄小鼠的病理變化及死亡數(shù)。

1.3 抗血栓活性測(cè)定

1.3.1小鼠斷尾出血時(shí)間的測(cè)定。昆明小鼠(28 g)，購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠分為2組：①治療組8只，用生理鹽水配制GYZC02發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物，濃度為100 mg/ml，每只小鼠灌胃0.5 ml,每日灌藥1次，用藥5 d后測(cè)定小鼠斷尾出血時(shí)間；②正常組：8只，灌生理鹽水。按照文獻(xiàn)[6]方法測(cè)定小鼠斷尾出血時(shí)間。

1.3.2抗小鼠尾動(dòng)脈血栓試驗(yàn)。小鼠尾動(dòng)脈血栓模型參照文獻(xiàn)[7]方法復(fù)制。將小鼠分為4組：①治療組:8只，用生理鹽水配制GYZC02發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物，濃度為100 mg/ml，每只小鼠灌胃0.5 ml,每日灌藥1次；②模型組：8只，灌生理鹽水；③陽(yáng)性藥組：8只，尿激酶用生理鹽水配成10萬(wàn)單位/ml，每只小鼠腹腔注射0.5 ml，每日1次；④正常對(duì)照組：8只，為不造模的正常小鼠。所有小鼠在相同的情況飼養(yǎng)，用藥2 d后，除正常對(duì)照組外，每只小鼠腹腔注射0.2%的角叉菜膠0.5 ml，48 h后觀察3組小鼠尾動(dòng)脈血栓形成情況， 記錄尾動(dòng)脈形成血栓的小鼠數(shù)，計(jì)算血栓形成率(%)，并測(cè)量小鼠尾血栓長(zhǎng)度(cm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化特征鑒定在普通瓊脂劃線培養(yǎng)24 h 后，菌落呈白色，不透明，隆起，邊緣不整齊，表面粗糙、干燥，不易挑起；革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，輕度渾濁，無(wú)沉淀，表面形成菌膜。菌株GYZC02的主要生理生化特征與枯草芽孢桿菌基本保持一致。

對(duì)菌株GYZC02 的16S rRNA 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，其序列為1 454 bp。將所測(cè)序列與GenBank上已登錄的同屬16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)。從圖2可以看，GYZC02菌株與登錄號(hào)為GU826165的菌株BacillussubtillisBL10(枯草芽孢桿菌)的同源性最高，達(dá)到100%。

根據(jù)GYZC02菌株的菌落、細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性，結(jié)合16S rRNA進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果，將GYZC02菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。

灌胃試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠15 d無(wú)死亡，處死小鼠后解剖未見(jiàn)任何病理變化，表明該菌株無(wú)致病性。

小鼠斷尾試驗(yàn)表明，治療組和陰性組小鼠斷尾試驗(yàn)出血時(shí)間出現(xiàn)明顯差異。治療組小鼠出血時(shí)間明顯高于陰性對(duì)照組，治療組小鼠的出血時(shí)間達(dá)到(13.9±1.8)min，而陰性組的血時(shí)間僅有(4.6±0.9)min，說(shuō)明GYZC02發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物明顯延長(zhǎng)了小鼠斷尾出血時(shí)間，具有明顯的抗凝效果。

從圖3可以看出，腹腔注射角叉菜膠后，小鼠形成了明顯的尾動(dòng)脈血栓，尾尖變黑。由表1可知，模型組、治療組和陽(yáng)性藥組小鼠尾動(dòng)脈血栓陽(yáng)性率分別為75.0%、62.5%和37.5%，模型組、治療組和陽(yáng)性藥組的尾動(dòng)脈血栓長(zhǎng)度分別為(1.27±0.23)、(0.56±0.13)和(0.60±0.10)cm，表明GYZC02菌株的次生代謝產(chǎn)物能明顯抑制小鼠尾動(dòng)脈血栓的形成，抗血栓藥效與陽(yáng)性藥基本一致。

表1 小鼠尾動(dòng)脈血栓形成率和尾動(dòng)脈血栓長(zhǎng)度

3 討論

微生物在地球上分布廣泛、品種眾多，其次生代謝產(chǎn)物解構(gòu)豐富，是藥物的重要來(lái)源。人類需要通過(guò)動(dòng)、靜脈血管和毛細(xì)血管供血維持其正常生理功能，如果出現(xiàn)血栓就會(huì)引起相關(guān)組織或器官供血不足，造成功能紊亂而導(dǎo)致疾病，嚴(yán)重時(shí)可危及生命[8-9]。該試驗(yàn)表明分離的細(xì)菌GYZC02為枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物具有抗血栓形成活性。

該菌株的次生代謝產(chǎn)物能延長(zhǎng)小鼠斷尾出血時(shí)間，表明具有抗凝活性；通過(guò)先給藥再造模的方法，該菌株的次生代謝產(chǎn)物能阻斷小鼠尾動(dòng)脈血栓形成，表明具有抗血栓形成的活性。此外，在前期體外溶栓試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)該菌株的次生代謝產(chǎn)物具有一定的溶栓能力。

微生物溶栓活性很早就受到重視，已經(jīng)證實(shí)一些細(xì)菌和真菌能夠產(chǎn)生溶栓酶。但是有關(guān)細(xì)菌的小分子在抗血栓方面的研究并未受到重視，GYZC02發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物以小分子為主，酶難以被乙酸乙酯萃取，即使能被部分萃取，經(jīng)過(guò)80 ℃蒸干，其結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被破壞，因此可斷定GYZC02菌株的抗血栓活性物質(zhì)為小分子化合物。 該研究豐富了微生物抗血栓方面的內(nèi)容，為開(kāi)發(fā)新型抗血栓藥物奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)行活性跟蹤分離及作用機(jī)制探討，相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

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Identification of Bacteria Strain GYZC02 and Study on Its Antithrombotic Active Substances

ZHANG Jian1, LI Qiang1, WANG Lun-xing1, YANG Zai-chang1,2 *et al

(1. Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy of Guizhou Province, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 2. School of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025)

[Objective] To identify bacteria strain of GYZC02 and study its antithrombotic activity. [Method] Morphological characteristic, biochemical test, and 16S rRNA sequence homology were used to identification of GYZC02 strain. The mouse tail bleeding time and arterial thrombosis model were used to assay the antithrombotic activity of GYZC02. [Result] The results of morphological, biochemical test, and 16S rRNA sequences revealed that the strains is a kind ofBacillussubtilis. By oral administration, the ethyl acetate extract GYZC02 broth could significantly prolong the bleeding time, and inhibit the formation of mouse tail artery thrombosis. [Conclusion]BacillussubtilisGYZC02 can produce small molecules with high antithrombotic activity.

GYZC02; Identification; Antithrombotic activity

貴州省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(SY字[2013]3058號(hào))；國(guó)家自然科學(xué)基金(81460531)。

張健(1987-)，男，貴州畢節(jié)人，碩士研究生，研究方向：生物制藥。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事具有生物學(xué)活性的天然產(chǎn)物的篩選工作。。

2014-11-24

S 852.6

A

0517-6611(2015)02-120-03