朱威龍， 閆 碩， 石冀哲， 吳鳳明， 李 貞， 張青文， 劉小俠

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲系，北京 100193)

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棉花不同組織DNA的不同提取方法比較

朱威龍， 閆 碩， 石冀哲， 吳鳳明， 李 貞， 張青文， 劉小俠*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲系，北京 100193)

[目的] 研究棉花不同組織DNA 提取的最佳方法。[方法]以棉花嫩葉、種子、黃化苗作為研究對象，比較CTAB法、SDS法、SDS-CTAB法提取DNA的效果。[結(jié)果]若對DNA的量沒有要求，棉花嫩葉、種子、黃化苗等組織均應(yīng)選用SDS-CTAB法提取DNA。若對DNA的量有一定要求，如濃度需大于100 ng/μl，質(zhì)量大于20 000 ng的情況下，針對不同試驗材料推薦使用的提取方法是：棉花嫩葉用CTAB法，棉花種子SDS法，棉花黃化苗CTAB法。[結(jié)論] 為快速高通量地檢測轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移距離和頻率提供參考。

棉花；嫩葉；種子；黃化苗；CTAB；SDS；SDS-CTAB

棉花是我國最重要的經(jīng)濟作物之一，2013年我國棉花種植面積達到472.06萬hm2，產(chǎn)量達到667.8萬t[1]，其中轉(zhuǎn)基因棉花種植面積為420萬hm2[2]。隨著Bt棉的大規(guī)模種植，基因漂移問題也成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點。轉(zhuǎn)基因作物中的外源基因可能會漂移到野生近緣種或雜草中，最終給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境帶來負面影響。轉(zhuǎn)基因作物的大量釋放很有可能增加農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的選擇壓力，甚至破壞原有物種之間的平衡關(guān)系[3-4]。因此，轉(zhuǎn)基因棉花的安全性評價是十分必要的，而對其基因漂移的頻率和距離進行檢測有賴于對樣品DNA的提取。有關(guān)棉花的研究多集中于分子輔助育種和基礎(chǔ)生物學(xué)等方面，而其分子標記和基礎(chǔ)生物學(xué)研究明顯滯后于水稻、玉米、油菜等其他作物，主要原因是其DNA的提取和純化較其他作物更困難[5-6]。棉花富含棉酚、多糖、單寧、蛋白等次生代謝物質(zhì)，這些次生代謝物易形成與核酸的復(fù)合物，影響所提取DNA的質(zhì)量[7]。

提取棉花DNA的方法主要有CTAB法[5,8]、SDS法[9-13]、SDS-CTAB法[7]。該試驗將棉花黃化苗作為研究對象之一，以期降低蛋白質(zhì)對DNA提取的影響，并在次生代謝物大量累計之前提取棉花DNA，探究其是否對棉花DNA的提取存在有利的影響。筆者以棉花種子、嫩葉為研究對象，找出棉花不同組織DNA的最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料轉(zhuǎn)基因抗蟲抗除草劑棉花(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供)的種子、嫩葉、黃化苗，非轉(zhuǎn)基因棉花石遠321。

1.2 DNA提取緩沖液及其成分CTAB提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl, 20 mmol/L EDTA, 2%CTAB(W/V), 2%PVP40(W/V), 8%NaCl(W/V), 2%β-巰基乙醇(W/V)。SDS提取緩沖液：1% SDS, 10 mmol/L EDTA, 8%NaCl(W/V), 50 mmol/L Tris-HCl, 0.5%山梨醇, 1%PVP40(W/V), 2%β-巰基乙醇(W/V)。TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA。

其他試劑：氯仿∶異戊醇(24∶1)，70%乙醇，無水乙醇，異丙醇，5 mol/L KAc。

1.3 DNA提取方法將棉花種子種于基質(zhì)(草炭∶蛭石=3∶1)中，未遮光處理得到棉花嫩苗，遮光處理得到棉花黃化苗。取棉花嫩葉圓片約1 cm2(約33.69 mg)，棉種約1/4(約19.29 mg)，棉花黃化苗圓片約1 cm2(約25.62 mg)。最后根據(jù)測出的DNA濃度計算得率：得率(ng/mg)=濃度(ng/μl) X 200(μl) /質(zhì)量(mg)。

1.3.1CTAB法。參照宋國立等[5]的方法并稍加改動，步驟如下：將稱量好的試驗材料置于2 ml離心管底部，加入小鋼珠，敞開管蓋放入冷凍干燥儀，冷凍干燥24 h后迅速放入球磨儀中振蕩研磨35 s(30Times/s)。然后加入經(jīng)65 ℃預(yù)熱的800 μl CTAB提取液，置于振蕩器上約30 s，放入65 ℃水浴中40 min，每隔10 min上下顛倒1次。水浴后加入800 μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下輕搖混勻約10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清(約600 μl)至1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)重提一次，10 000 r/min離心10 min。重取上清(約500 μl)至新1.5 ml離心管中，加入2倍體積(約1 ml)經(jīng)-20 ℃預(yù)冷無水乙醇，緩慢顛倒離心管15次以上。于-20 ℃冰浴靜置30 min以上，然后12 000 r/min離心7 min。小心傾去上清，用70%乙醇洗2次，無水乙醇洗1次，風(fēng)干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.3.2SDS法。參照郭寶生等[12]、劉峰等[13]、匡猛等[14]的方法并稍加改動，步驟如下：將稱量好的試驗材料置于2 ml離心管底部，加入小鋼珠，敞開管蓋放入冷凍干燥儀，冷凍干燥24 h后迅速放入球磨儀中振蕩研磨35 s(30 Times/s)。然后加入經(jīng)65 ℃預(yù)熱的800 μl SDS提取液，置于振蕩器上約30 s，放入65 ℃水浴中40 min，每隔10 min上下顛倒1次。水浴后加入800 μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下輕搖混勻約10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清(約600 μl)至1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)重提一次，10 000 r/min離心10 min。重取上清(約500 μl)至新1.5 ml離心管中，加入2倍體積(約1 ml)經(jīng)-20 ℃預(yù)冷異丙醇，緩慢顛倒離心管15次以上。于-20 ℃冰浴靜置30 min以上，然后12 000 r/min離心7 min。小心傾去上清，用70%乙醇洗2～3次，無水乙醇洗1次，風(fēng)干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.3.3SDS-CTAB。參照孫鑫等[7]的方法并稍加改動，步驟如下：將稱量好的試驗材料置于2 ml離心管底部，加入小鋼珠，敞開管蓋放入冷凍干燥儀，冷凍干燥24 h后迅速放入球磨儀中振蕩研磨35 s(30 Times/s)。然后加入經(jīng)65 ℃預(yù)熱的600 μl SDS提取液，置于振蕩器上約30 s，于65 ℃水浴40 min。加入200 μl 5 mol/L KAc混勻，冰浴30 min，4 ℃離心，12 000 r/min，10 min。取上清，加入200 μl CTAB提取液，充分混勻，65 ℃水浴20 min。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，室溫離心10 000 r/min，10 min。取上清，加入-20 ℃預(yù)冷的異丙醇1 000 μl，緩慢顛倒離心管15次以上。于-20 ℃冰浴靜置30 min以上，然后12 000 r/min離心7 min。小心傾去上清，用70%乙醇洗2～3次，無水乙醇洗1次，風(fēng)干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.4 DNA的質(zhì)量檢測。

1.4.1紫外分光光度法檢測。以TE作為空白對照，利用微量紫外分光光度計(Nanodrop2000, Thermo Scientific)檢測所提取棉花DNA的濃度、OD260/280，并根據(jù)提取DNA前稱量的質(zhì)量計算得率。其中OD260/280應(yīng)在1.8～2.2符合要求。

1.4.2PCR及電泳檢測

1.4.2.1DNA模板稀釋。因PCR使用DNA模板2 μl，同時需要保證PCR反應(yīng)體系內(nèi)DNA的含量介于20～50 ng，該試驗用TE對DNA樣本統(tǒng)一稀釋至30 ng/μl，置于-20 ℃保存待用。

1.4.2.2DNA樣品的PCR擴增和電泳檢測。由于所選棉花材料都是轉(zhuǎn)基因抗蟲抗除草劑棉花品種，故選用特異性引物對樣品內(nèi)CryⅠA(c)基因進行PCR定性檢測。上下游引物分別為5′GAAGGATTGAGCAATCTCTAC 3′和5′CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3′[4]。 PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μl(北京強欣博瑞生物技術(shù)有限公司)，上下游引物(10 μ/mol)各0.5 μl(上海生工生物技術(shù)有限公司)，DNA模板2 μl，ddH2O 7 μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃4 min，變性94 ℃ 1 min、退火56 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后總延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增基因CryⅠA(c)的目的片段約為340 bp，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度的比較對于棉花嫩葉而言，獲得DNA濃度最高的方法是CTAB法，SDS法平均濃度達到197 ng/μl以上；對于棉花種子而言，獲得DNA濃度最高的方法是SDS法，CTAB法平均濃度達到294 ng/μl以上；對于棉花黃化苗而言,獲得DNA濃度最高的方法是SDS法，CTAB法平均濃度達到205 ng/μl以上。這3種材料提取DNA濃度最低的都是SDS-CTAB法，其平均值都低于101 ng/μl(表1)。

對于3種材料的濃度最高值而言：棉花種子(SDS法)>棉花黃化苗(SDS法)>棉花嫩葉(CTAB法)。

對所有試驗材料所有方法而言，濃度排在前3位的方法是棉花種子(SDS法)、棉花黃化苗(SDS法)、棉花嫩葉(CTAB法)。

表1 不同方法提取不同材料DNA的濃度比較

2.2 DNA的OD260/280比較對于棉花嫩葉和棉花黃化苗而言，所有方法的OD260/280都在1.8～2.2；對于棉花種子而言，只有SDS-CTAB法的OD260/280在1.8～2.2，且顯著高于CTAB法和SDS法(表2)。

表2 不同方法提取不同材料DNA的OD260/280比較

2.3 DNA得率的比較對于棉花嫩葉而言，獲得DNA得率最高的方法是CTAB法，SDS法平均得率達到1 280 ng/mg以上；對于棉花種子而言，獲得DNA得率最高的方法是SDS法，CTAB法平均得率達到3 160 ng/mg以上；對于棉花黃化苗而言，獲得DNA得率最高的方法是SDS法，CTAB法平均得率達到1 624 ng/mg以上。這3種試驗材料獲得DNA得率最低的都是SDS-CTAB法，其平均值都低于1 000 ng/mg(表3)。

表3 不同方法提取不同材料DNA的得率比較

對于3種試驗材料的得率最高值而言：棉花種子(SDS法)>棉花黃化苗(SDS法)>棉花嫩葉(CTAB法)。

對所有試驗材料所有方法而言，得率排在前3位的方法是棉花種子(SDS法)、棉花黃化苗(SDS法)、棉花種子(CTAB法)。

2.4 不同方法和不同材料提取棉花DNA的PCR檢測由圖1可知，不同方法提取不同材料DNA清晰程度由高到低為葉(SDS-CTAB)>種(SDS-CTAB)>黃(SDS-CTAB)>葉(CTAB)>種(SDS)>葉(SDS)>黃(CTAB)>種(CTAB)>黃(SDS)。

3 討論

(1)若后續(xù)試驗對DNA的量沒有要求，則棉花嫩葉、種子、黃化苗等組織都應(yīng)選用SDS-CTAB法提取DNA；若后續(xù)試驗材料有限，或?qū)μ崛NA的量有一定要求(如濃度需大于100 ng/μl，質(zhì)量大于20 000 ng等)，則這3種棉花組織都不能用SDS-CTAB法提取DNA。由于電泳圖結(jié)果不理想，以下方法不推薦作為提取棉花組織DNA的方法：棉花種子(CTAB法)、棉花黃化苗(SDS法)。

對提取DNA的量有一定要求的情況，即不考慮SDS-CTAB法：對于棉花嫩葉而言，CTAB法在DNA濃度、OD260/280、DNA得率、電泳圖清晰度方面，都明顯優(yōu)于SDS 法。所以對于棉花嫩葉，在對提取DNA的量有一定要求的情況下，推薦選用CTAB法。

對于棉花種子而言，CTAB法由于電泳圖結(jié)果不理想而不被推薦使用。SDS 法雖然OD260/280較低，但DNA濃度、DNA得率非常高，且電泳圖清晰，符合試驗要求。所以對于棉花種子，在對提取DNA量有一定要求的情況下，推薦選用SDS法。

對于棉花黃化苗而言，SDS法由于電泳圖結(jié)果不理想而不被推薦使用。CTAB法在DNA濃度、OD260/280、DNA得率、電泳圖清晰度方面，都符合試驗要求，所以在對提取DNA的量有一定要求的情況下，推薦選用CTAB法。

(2)棉花黃化苗(CTAB法)提取DNA濃度較棉花嫩葉(CTAB法)和棉花種子(CTAB法)雖然略低，但由于其樣品質(zhì)量較棉花嫩葉小，所以其得率與棉花嫩葉(CTAB法)沒有顯著差異，且其OD260/280在1.8～2.2，雖然其電泳圖效果符合試驗要求且清晰程度優(yōu)于棉花種子(CTAB法)，但不如棉花嫩葉(CTAB法)。

棉花黃化苗(SDS法)提取DNA濃度和得率較棉花嫩葉(SDS法)高，較棉花種子(SDS法)低，且其OD260/280在1.8～2.2，但其電泳圖清晰度不符合試驗要求且都不如棉花嫩葉和棉花種子SDS法的電泳圖清晰。

棉花黃化苗(SDS-CTAB法)提取DNA濃度較棉花嫩葉(SDS-CTAB法)和棉花種子(SDS-CTAB法)高；提取DNA得率較棉花嫩葉(SDS-CTAB法)高，與棉花種子(SDS-CTAB法)沒有顯著差異。且其OD260/280在1.8～2.2，電泳圖清晰度符合試驗要求。

雖然棉花黃化苗(SDS法)提取DNA的OD260/280在1.8～2.2，但其PCR及電泳結(jié)果不符合試驗要求；而棉花種子(SDS法)提取DNA的OD260/280不在1.8～2.2，但其PCR及電泳結(jié)果符合試驗要求。所以O(shè)D260/280與PCR及電泳結(jié)果之間沒有必然的聯(lián)系。

SDS-CTAB法濃度普遍偏低是因為在加入氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提前就已離心，大大減少了雜質(zhì)對DNA純度的影響，使得提取的3種試驗材料DNA樣品的OD260/280平均都在2.0以上。但這一步離心也使得部分DNA被當作沉淀棄掉，導(dǎo)致SDS-CTAB法提取的DNA濃度很低。

轉(zhuǎn)基因棉花的安全性評價需要對其基因漂移的距離和頻率進行檢測，而提取棉花DNA是檢測基因漂移的必要步驟，快速高通量的提取棉花DNA并對其進行檢測有利于提高效率。專門針對提取棉花DNA的試劑盒昂貴，不適合高通量的檢測[16]，且對棉花葉子的檢測需要先在室內(nèi)發(fā)苗，檢測周期長[13,17]，用棉花種子(SDS法)直接檢測可以縮短檢測周期，提高工作效率，該試驗也為快速高通量地檢測轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移距離和頻率提供了參考。

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The Comparative Research on DNA Extraction from Different Organizations by Different Methods

ZHU Wei-long, YAN Shuo, SHI Ji-zhe, LIU Xiao-xia*et al

(Department of Entomolagy, China Agricultural University, Beijing 100193)

[Objective] The aim was to study the comparative on DNA extraction from different organizations by different methods. [Method]The materials of this research were young leaves, seeds and etiolated seedlings of cotton, the effects among methods of CTAB, SDS, SDS-CTAB were compared. [Result] According to the results, if further experiment does not have high requirement of the quantity of DNA, the method of SDS-CTAB should be applied to extracting DNA from young leaves, seeds and etiolated seedlings of cotton. If further experiment has high requirement of the quantity of D NA ( Concentration should be above 100 ng/μl. Mass should be above 20 000 ng), the best methods for different materials are that: method of CTAB for young leaves of cotton, method of SDS for seeds of cotton, method of CTAB for etiolated seedlings. [Conclusion] The study provided reference for detection of cotton.

Cotton; Young leaf; Seed; Etiolated seedling; CTAB; SDS; SDS-CTAB

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08011002-006)。

朱威龍(1989- )，男，廣西柳州人，碩士研究生，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全評價。*通訊作者。

2014-11-27

S 562

A

0517-6611(2015)02-016-03