李金娣，武亦珂，武嘯劍

(1.洛陽市精神衛(wèi)生中心，河南洛陽 471013；2.河南海絲克生物科技股份有限公司，河南洛陽 471000 )

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槲皮素氧化前后對果蠅壽命和抗氧化活性的影響

李金娣1，武亦珂2，武嘯劍2

(1.洛陽市精神衛(wèi)生中心，河南洛陽 471013；2.河南海絲克生物科技股份有限公司，河南洛陽 471000 )

[目的] 探討槲皮素氧化前后對果蠅壽命和抗氧化活性的影響。[ 方法] 以果蠅為試材，培養(yǎng)基添加氧化前后的槲皮素，(25±1)℃下培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)移到(33±1)℃下培養(yǎng)到全部死亡，期間取材測定。分別采用氮藍(lán)四唑(NBT)法、硫代巴比妥酸(TBA)法、流動注射化學(xué)發(fā)光方法和HPLC法，測定不同天數(shù)的果蠅體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、羥自由基的清除率及其體內(nèi)槲皮素的含量。 [結(jié)果] 果蠅壽命和抗氧化活性是以槲皮素、氧化槲皮素、對照的順序遞減。[結(jié)論]光照、高溫和高濕的環(huán)境使得槲皮素的抗氧化活性降低。

槲皮素；抗氧化活性；清除自由基；HPLC；流動注射化學(xué)發(fā)光

槲皮素廣泛分布在殼斗科、小檗科、金絲桃科、夾竹桃科等植物中，并且在日常食物也比較常見，比如在洋蔥、蘋果、茶葉、紅酒、花椰菜和銀杏中含量較高[1]。槲皮素具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤作用，還有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用。除具有以上藥理作用外，還具有降糖、止瀉、鎮(zhèn)痛[2]、抗血栓、抗肥胖、抗抑郁等作用。因此，槲皮素不僅可以作為藥物應(yīng)用于人體預(yù)防和治療疾病，而且可以作為食品和化妝品添加劑，防止食品和化妝品氧化。

近年來，隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，人們對健康指數(shù)的要求也越來越高，因此抗氧化抗衰已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)?；陂纹に氐倪@些生物活性，其抗氧化活性成為人們的研究重點(diǎn)。槲皮素作為一種活性高、純天然的抗氧化劑用于食品和化妝品中，避免了合成抗氧劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、沒食子酸丙酯(PG)等帶來的副作用[3]。在這些含有槲皮素的藥品和含有槲皮素添加劑的食品、化妝品中時(shí)常可以見到有用透明玻璃瓶子存放、暴露于光線下面甚至夏季置于高溫的地方。如此 放置和儲存含蘆丁的藥物、食品和化妝品使得槲皮素的生物活性尤其是抗氧化性是否一致尚不清楚。因此，以模式動物——果蠅作為研究對象，對其體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、槲皮素含量進(jìn)行測定，進(jìn)一步利用流動注射化學(xué)發(fā)光法對果蠅體內(nèi)羥基自由基清除率進(jìn)行測定，闡述槲皮素氧化前后抗氧化活性的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(圖1)在-20 ℃避光保存；將槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品置于(30±1) ℃恒溫、相對濕度(RH) 60%條件下光照6個(gè)月。光照處理下槲皮素顏色的變化見圖2。供試動物為野生型紅眼灰身長翅果蠅。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備。對照為基本培養(yǎng)基[4]，組成為玉米粉、蔗糖、瓊脂、酵母粉、苯甲酸鈉；處理①在對照基本培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.01%的槲皮素；處理②在對照基本培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.01%的氧化槲皮素。

1.2.2給藥及分組。收集8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，雌雄分開，分6組，每組3瓶，每瓶約150只，每5 d更換一次培養(yǎng)基。試驗(yàn)第1階段在室溫(25±1) ℃，試驗(yàn)第2階段(6～13 d)在高溫(33±1) ℃、RH 60%條件下飼養(yǎng)，并且每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅死亡數(shù)目，直至全部死亡。

1.2.3SOD活性測定。采用NBT法[5-6]。取雌或雄果蠅20只，置于預(yù)冷的研缽中，加磷酸緩沖液3 ml，研成勻漿，在 4 ℃、6 000 r/min下離心10 min，然后取上清液 0.2 ml，依次加SOD混合液5.8 ml，25～35 ℃光照反應(yīng)10 min。測定結(jié)果以每克果蠅的SOD活力單位數(shù)表示(U/g)。

1.2.4MDA含量測定。采用硫代巴比妥酸(TBA)法[5]。取雌或雄果蠅50只，置于預(yù)冷的研缽中，加濃度10%三氯乙酸(TCA)，研成勻漿，在常溫4 000 r/min下離心20 min，然后取上清液 0.25 ml，加濃度0.6%硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴15 min，冷卻后在波長450、532、600 nm處測其吸光值。測定結(jié)果以每克勻漿含MDA摩爾數(shù)表示(mol/g)。

1.2.5類黃酮對羥自由基清除率的測定。Fe2+、亞甲基藍(lán)、過氧化氫及水通過相應(yīng)管路輸入流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)，記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為I0；以樣品溶液代替水，記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為Is，發(fā)光強(qiáng)度的降低值ΔI作為清除羥自由基的度量。清除率(E)計(jì)算公式[7]為：

E= (ΔI/I0)×100%

(1)

1.2.6HPLC測定槲皮素。

1.2.6.1測定條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精密稱取槲皮素對照品10 mg，以甲醇溶解并定容至10 ml，得對照品儲備液。分別吸取槲皮素的儲備液0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 ml于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 ml[8]。LC-20A高效液相色譜儀的色譜條件為：色譜柱Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為甲醇∶濃度1%乙酸為60∶40，紫外檢測器，檢測波長360 nm，流速1.0 ml/min。依據(jù)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:

Y=3.180×107X-161 536.799

(2)

式中，Y為峰面積，X為濃度(mg/ml)。

1.2.6.2果蠅體內(nèi)槲皮素含量測定。取果蠅30只，置于研缽中，加1 ml 流動相研磨，將勻漿置于室溫、8 000 r/ min離心20 min，然后取上清液。處理①和處理②按照0.1 mg/ml槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液∶果蠅上清液1∶3的比例處理樣品，得到處理①和處理②樣品。對照組按照上述的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液∶果蠅上清液1∶3的比例處理樣品，得到對照樣品。在上述色譜條件，測定對照樣品Ax以及處理①、處理②樣品As。

△c=△s(處理樣品)-△x(對照品)

(3)

含量(%)=△c×V/M×100%

(4)

利用外標(biāo)法計(jì)算果蠅體內(nèi)槲皮素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素和氧化槲皮素對果蠅壽命的影響在(25±1) ℃下飼養(yǎng)1～5 d，處理①、處理②和對照組果蠅基本無明顯死亡。在(33±1) ℃下飼養(yǎng)6～9 d，果蠅死亡數(shù)明顯增加，直至13 d果蠅全部死亡。這符合方程Y=aX3+bX2+cX+d。

由圖3、4和表1可知，處理①、②和對照果蠅剩余50%時(shí)的天數(shù)分別是雌性8.27、7.80和7.46，雄性9.00、7.89和7.70。可見，槲皮素或氧化槲皮素的添加對壽命均有所延長，但是前者更加明顯。

表1 不同處理下果蠅壽命標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)

2.2 槲皮素和氧化槲皮素對果蠅體內(nèi)SOD和MDA的影響由表2可知，25 ℃培養(yǎng)1 d時(shí)，對照、處理①和處理②的雄性SOD活性分別是各組內(nèi)雌性的1.7、1.1和1.4倍，可見雄性均大于同組雌性，說明在同樣條件下雄性SOD活性大于雌性。其次，處理①、處理②的雌性和雄性SOD活性分別是對照組雌性的4.6、3.2倍和雄性的3.0、2.7倍，差異在0.01水平顯著，說明只要添加槲皮素，SOD均有明顯增加。第三，處理①和處理②相比，后者略有降低。到了第5天，變化不大，但是與1 d相比，對照的雌、雄性和處理②的雌性SOD活性分別增加了3.2、2.2和1.3倍。

33 ℃培養(yǎng)1 d時(shí)，對照、處理①和處理②的雄性SOD活性分別是各組內(nèi)雌性的2.5、1.1和1.7倍，可見雄性均大于同組雌性，說明在同樣條件下雄性SOD活性大于雌性。其次，處理①、處理②的雌性和雄性SOD活性分別是對照組雌性的3.8、2.2倍和雄性的1.6、1.4倍，差異在0.01水平顯著，說明高溫能夠加速機(jī)體的衰老，但是添加槲皮素后SOD活性均有明顯增加。第三，處理①和處理②相比，后者略有降低。與25 ℃培養(yǎng)1 d時(shí)相比，對照的雄性SOD活性增加了1.5倍，處理①和處理②的SOD活性均降低；到了第2天，對照、處理①和處理②的雄性SOD分別是各組內(nèi)雌性的3.8、1.6和3.0倍，可見在同樣條件下雄性SOD活性大于雌性。其他基本變化不大。

表2 槲皮素和氧化槲皮素對果蠅體內(nèi)SOD活性的影響 U/g

注：處理①、處理②與對照比較為a、b；處理①與處理②比較為c；同組內(nèi)雄雌比較為d；與1d比較為e。小寫為P<0.05；大寫為P<0.01。

由表3可知，隨著時(shí)間的增加，MDA含量呈上升趨勢；處理①、處理②MDA含量低于對照組，處理①最為顯著。低含量的MDA說明果蠅抵抗自由基能力較高，可見添加槲皮素和氧化槲皮素后，果蠅的抗氧化能力提高。在(25±1) ℃下飼養(yǎng)1～5 d，處理①和處理②的果蠅體內(nèi)MDA含量低于對照，并且隨時(shí)間的增加而降低。(33±1) ℃環(huán)境飼養(yǎng)6～8 d中，隨著時(shí)間的增加，對照的果蠅體內(nèi)MDA含量逐漸增加，說明高溫環(huán)境會加速果蠅的衰老。處理①和處理②的果蠅體內(nèi)MDA含量也逐漸降低，處理①效果最為顯著，說明槲皮素對雌果蠅的抗自由基能力顯著。

注：處理①與對照相比較，不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表4 槲皮素和氧化槲皮素對果蠅體內(nèi)羥自由基清除率 %

2.3 槲皮素和氧化槲皮素對果蠅體內(nèi)羥自由基清除率的影響在制備果蠅培養(yǎng)基前，對槲皮素和氧化槲皮素清除羥自由基的能力進(jìn)行了測定。由圖5可知，槲皮素和氧化槲皮素清除率分別是55.58%±0.30%(100%)和52.98%±0.97%(95%)，后者的清除率降低了5%，顏色也有改變。

由表4可知，隨著時(shí)間的增加，處理①、處理②對果蠅體內(nèi)羥自由基清除率呈上升趨勢，槲皮素對雄果蠅體內(nèi)羥自由基的清除率更為顯著。在(25±1) ℃下飼養(yǎng)1～5 d，處理①和處理②果蠅體內(nèi)自由基清除率隨時(shí)間的增加而降低。這說明隨著時(shí)間的增加果蠅機(jī)體在逐漸衰老。(33±1) ℃環(huán)境飼養(yǎng)6～8 d中，隨著時(shí)間的增加，處理①和處理②的果蠅體內(nèi)自由基清除率逐漸增加，說明槲皮素和氧化槲皮素具有清除體內(nèi)自由基的作用，延緩果蠅機(jī)體的衰老。

2.4 不同處理果蠅體內(nèi)槲皮素的含量利用外標(biāo)法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y(mg/ml)= 3.180×107X-161 536.799。對槲皮素和氧化槲皮素的含量分別是0.100 7和0.098 8 mg/ml。依次對25、33 ℃處理①、②的果蠅進(jìn)行體內(nèi)槲皮素含量的測定。由表5可知，處理①果蠅體內(nèi)槲皮素含量高于處理②。

表5 不同處理下果蠅體內(nèi)槲皮素的含量 mg/kg

3 討論

果蠅作為模式動物，具有生存周期短、繁殖量大、飼養(yǎng)簡便、反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，其代謝系統(tǒng)、生理功能、生長發(fā)育與哺乳動物基本相似。另外，果蠅體內(nèi)存在和人類相似的衰老基因，在進(jìn)行藥物篩選、藥物毒理和抗衰老等方面的研究時(shí)，可將其作為一種很好的實(shí)驗(yàn)材料[9-12]。槲皮素可以延緩衰老。這已得到多方面試驗(yàn)的證實(shí)。其抗氧化性體現(xiàn)在抗衰老藥物方面，并且已作為添加劑被廣泛用于食品和化妝品領(lǐng)域。

研究表明，槲皮素和氧化槲皮素均可延長果蠅壽命，使果蠅體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)，MDA含量降低，增強(qiáng)對體內(nèi)羥自由基的清除率。其次，槲皮素的抗氧化效果比氧化槲皮素更顯著。第三，當(dāng)進(jìn)行果蠅體內(nèi)槲皮素含量測定時(shí)，處理①含量大于處理②?？梢?，光照、高溫和高濕的環(huán)境使得槲皮素的抗氧化活性降低，隨著時(shí)間的增加，其抗氧化活性的藥效逐漸降低。

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Effects of Inoxidized and Oxygenated Quercetin on the Life-span of Drosophilae and the Antioxidant Activity

LI Jin-di1, WU Yi-ke2, WU Xiao-jian2

(1.Louyang Mental Health Center, Louyang, Henan 471013; 2. Hennan Health Care Biotechnology Co. Ltd, Luoyang, Henan 471000)

[Objective] The aim was to discuss the effect of inoxidized and oxygenated quercetin on life-span and the antioxidant activity. [Method] With Drosophila melanogaster as the tested material, they were placed on the medium made by quercetin and oxygenated quercetin to be cultured at (25±1)℃ for 5 days. After that transfer them to (33±1)℃ until death wholly and we drawn them to determine. NBT method, TBA method, the flow injection chemiluminescence method and the HPLC method were used to determine the superoxide dismutase (SOD) activity, the malondialdehyde (MDA) content, the scavenging effect of hydroxyl radical and the content of rutin in D. melanogaster on different days. [Result] In order of quercetin, oxygenated quercetin, control, the life-span and the antioxidant activity of Drosophila melanogaster were decreased.[Conclusion]Light,high temperature and high humidity environment could reduce the antioxidant activity of quercetin.

Quercetin; Antioxidant activity; Scavenging free radicals; HPLC; Flow injection chemiluminescence

國家自然科學(xué)基金(31060193)；桂林理工大學(xué)科研啟動費(fèi)。

李金娣(1985-)，女，河南洛陽人，藥師，碩士，從事臨床藥學(xué)方面的研究。

2014-11-28

S 853.7

A

0517-6611(2015)02-009-03