曾俏慧 吳 純 盧 飛 趙浩斌 鐘雪萍 周青春

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430079)

斑馬魚4個(gè)小maf時(shí)空表達(dá)分析及在調(diào)控胰外分泌酶原基因表達(dá)中的作用研究

曾俏慧 吳 純 盧 飛 趙浩斌 鐘雪萍 周青春

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430079)

Maf蛋白家族作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 參與細(xì)胞眾多生命進(jìn)程。它分為大Maf蛋白和小Maf蛋白, 小Maf蛋白需要與其他B-Zip家族蛋白結(jié)合形成異二聚體才能發(fā)揮作用。在斑馬魚(Danio rerio)中, 小Maf包括Mafk、Mafg1、Mafg2和Maft, Mafg1和Mafg2是Mafg在魚類中特有的分化出的兩個(gè)旁系同源基因。為了研究這4個(gè)小maf在物種之間的進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)模式, 實(shí)驗(yàn)對4個(gè)小maf進(jìn)行進(jìn)化樹、染色體線性關(guān)系分析, 結(jié)果顯示4個(gè)小maf的分子進(jìn)化方向與物種進(jìn)化方向一致, mafk和maff在物種間的更趨于保守, mafg比前兩者要相對活躍。同時(shí), 實(shí)驗(yàn)選取斑馬魚胚胎發(fā)育十個(gè)不同時(shí)期(1 cell、2 cells、3.5 hpf、6 hpf、12 hpf、24 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf), 對其表達(dá)模式進(jìn)行了詳細(xì)的研究, 結(jié)果顯示4個(gè)小maf中, mafg2的表達(dá)量最高, maft和mafk的表達(dá)量次之, mafg1的表達(dá)量最低。在胚胎發(fā)育的后期(48 hpf), 除了mafg2在軀干的血液循環(huán)處有明顯的表達(dá), maft在軀干的血液循環(huán)處有較弱的表達(dá), 而除mafk和mafg1在血液循環(huán)處沒有檢測到表達(dá)之外, 4個(gè)基因的表達(dá)部位基本重疊, 都在全身廣泛表達(dá), 這可能也與它們之間存在功能疊加和替換有關(guān)。利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測了4個(gè)小Maf參與調(diào)控胰外分泌酶原基因轉(zhuǎn)錄的不同功能, 結(jié)果顯示4個(gè)小maf的過表達(dá)都能使胰外分泌酶原基因的表達(dá)下調(diào)。研究結(jié)果將為深入研究4個(gè)小maf基因的功能疊加和互補(bǔ)作用奠定基礎(chǔ)。

斑馬魚; maf; 原位雜交; 胰外分泌酶原基因

Maf (Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene)蛋白家族作為bZIP(Basic and leucine zipper, bZIP)蛋白家族中的一員, 蛋白結(jié)構(gòu)具有典型的bZIP結(jié)構(gòu),是V-Maf (Avian musculoaponeurotic fibrosarcoma virus)的同源基因[1,2], 可以與bZIP蛋白家族中其他成員,形成二聚體或者異二聚體, 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 調(diào)控細(xì)胞內(nèi)眾多生命進(jìn)程。

Maf蛋白家族包括大Maf蛋白(大于200個(gè)氨基酸)和小Maf蛋白(小于200個(gè)氨基酸)[3,4]。大Maf蛋白包括c-Maf/Maf2[5]、MafB/Maf1[6]、Nrl[7]和L-Maf/ MafA/SMaf[8—10]、Krml1[11]、Zkrml2[12]; 小Maf蛋白包括MafK、MafF[13]和MafG[14], 最早發(fā)現(xiàn)是在原雞(Gallus gallus)中, 后來Yaeko Yakagi等[15]的研究表明, 在斑馬魚中也存在小maf基因, 包括mafk的一個(gè)同源基因和mafg的兩個(gè)同源基因, 即mafg1和mafg2,但是沒有找到maff的同源基因, 而發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的小maf基因, 并命名為maft (small maf in Teleost)。在紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)中的搜索結(jié)果同斑馬魚類似, 沒有發(fā)現(xiàn)maff, 只有maft。這些分析表明, mafk和mafg在物種進(jìn)化過程中比較保守, 而maff可能在魚類分化時(shí)就產(chǎn)生了分支, 并在魚類基因組中形成了maft。不過maff和maft基因在各自的物種中有沒有特殊的功能仍未可知[15]。

在斑馬魚中半定量研究結(jié)果顯示, maft在成年的斑馬魚(7個(gè)月)中全身廣泛表達(dá), 特別是腦中表達(dá)量最高, 而在鰓、心臟以及腸處表達(dá)最少, mafg2除了在膀胱處的表達(dá)較弱之外, 其表達(dá)模式與maft相似, mafg1在肝臟和睪丸組織中的表達(dá)量較其余三個(gè)基因的表達(dá)量高, 但是也是在斑馬魚全身組織廣泛表達(dá), mafk和mafg2的表達(dá)模式最相似。并且4個(gè)基因在斑馬魚胚胎不同發(fā)育時(shí)期(8 hpf、12 hpf、24 hpf、48 hpf、4d、7d)的半定量檢測結(jié)果顯示, 4個(gè)小maf基因從8 hpf時(shí)就都能檢測到表達(dá), 但是在胚胎發(fā)育早期(48 hpf之前)的表達(dá)量較低[15]。

在小鼠(Mus musculus)中, 小maf在胚胎發(fā)育過程中, 具有很復(fù)雜的表達(dá)模式, mafk和mafg雖然在各個(gè)組織中的表達(dá)分布模式不同, 但是在各個(gè)組織中廣泛表達(dá), 而maff在肺部具有較高的表達(dá)水平,在其他組織中的表達(dá)量都很低, 需要注意的是, 在整個(gè)胚胎發(fā)育過程中, 在造血細(xì)胞中都沒有檢測到maff基因的表達(dá)[16]。在人中, mafk在心臟、骨骼肌和胎盤處高表達(dá), 而mafg僅在骨骼肌處較高表達(dá), 在心臟和腦處表達(dá)量處于一般水平, 但是兩個(gè)基因都在所有的造血細(xì)胞系中廣泛表達(dá); maff在腎臟和妊娠母體子宮肌層表達(dá), 在非妊娠母體的子宮肌層中沒有檢測到表達(dá)[13,17—20]。

大Maf蛋白和小Maf蛋白都通過Maf識別元件MARE (MAF recognition element)調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄, 所不同的是, 大Maf蛋白在N端包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活基序, 可以自己直接參與基因的調(diào)控, 而小Maf蛋白缺乏轉(zhuǎn)錄激活基序, 需要與其他bZIP蛋白家族成員通過形成二聚體或者異二聚體, 才能識別MARE位點(diǎn)對下游基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[21]。已有的研究表明, Maf-Nrf2/Bach1路徑參與調(diào)控胰外分泌酶原基因, 當(dāng)Mafk與Nrf2a形成異二聚體時(shí)促進(jìn)胰外分泌酶原基因的表達(dá), 當(dāng)Mafk與Bach1形成異二聚體時(shí)則抑制胰外分泌酶原基因的表達(dá)[22]。

此外, 有研究表明, 在不同物種中, 小 Maf的各旁系同源基因之間的表達(dá)模式基本重合, 并且小Maf之間存在功能替換[14,23], 在敲除MAFG蛋白的小鼠體內(nèi), 超表達(dá)MAFk蛋白可以補(bǔ)償MAFG的缺失[24]。缺失所有三種小 MAF的小鼠表現(xiàn)為胚胎致死, 同時(shí)一系列結(jié)果表明, 小MAF蛋白對于應(yīng)激反應(yīng)和去毒作用中基因的轉(zhuǎn)錄激活具有十分重要的作用[25,26]。但目前, 對4個(gè)小maf基因在斑馬魚胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期詳盡的時(shí)空表達(dá)模式以及除了 Mafk之外的其他3個(gè)小Maf對于胰外分泌酶原基因的調(diào)控功能尚未見報(bào)道[22]。本文采用 RT-PCR、胚胎整體原位雜交技術(shù)和雙熒光素酶檢測系統(tǒng), 研究斑馬魚4個(gè)小maf基因mRNA的時(shí)空表達(dá)模式, 及其在調(diào)控胰外分泌酶原基因轉(zhuǎn)錄中的作用研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中使用的斑馬魚由本實(shí)驗(yàn)室采用28℃恒溫循環(huán)水系統(tǒng)飼養(yǎng)、繁殖。人293細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫培養(yǎng), 5% CO2供給, 培養(yǎng)血清劑量為10%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

RT-PCR檢測4個(gè)小maf基因在斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá) 取受精后 12h之內(nèi)的斑馬魚胚胎, 利用胰蛋白酶(4%濃度)脫膜處理后, 浸泡在0.06%苯硫脲(N-phenylthiourea, PTU)溶液中, 每天早晚各換一次培養(yǎng)液, 每管收集發(fā)育至不同階段的斑馬魚胚胎各20枚, 用Trizol法提取各自的總RNA,具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。Dnase Ⅰ酶解可能殘余的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA的完整性, 紫外分光光度法測定RNA樣品的濃度和純度。將提取得到的各個(gè)斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse Transcriptase M-MLV和oligo(dT)合成第一鏈模板DNA, 然后以cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng), 跨基因3′端設(shè)計(jì)特異性引物, 對基因進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。mafk基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 63 ℃ 30s; 72 ℃ 1min。mafg1基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 54 ℃ 30s; 72 ℃ 45s 。mafg2基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 58 ℃ 30s; 72 ℃ 45s 。maft基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 58 ℃ 30s; 72 ℃ 1min 。β-actin基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 30s; 55℃ 30s; 72 ℃ 1min 。每個(gè)基因的表達(dá)量以β-actin為參照在凝膠電泳時(shí)調(diào)節(jié)上樣量。

地高辛標(biāo)記的正、反義RNA探針的合成 用與RT-PCR實(shí)驗(yàn)中相同的引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,將目的片段插入pGEM-T Easy載體, 陽性克隆送華大基因測序, 將測序正確的并且是正向插入pGEMT Easy載體的克隆分別命名為 T-mafk、T-mafg1、T-mafg2和T-maft, 作為T7系統(tǒng)合成反義探針的模板。堿裂解法提取T-mafk、T-mafg1、T-mafg2和T-maft質(zhì)粒, 以M13-F和M13-R為引物, 提取的質(zhì)粒(稀釋到1—10 ng)為模板PCR, 電泳, 切下1000 bp左右大小的條帶, 膠回收, 即得到線性化的 mafk、mafg1、mafg2和maft探針轉(zhuǎn)錄模板DNA。體外轉(zhuǎn)錄mRNA探針的反應(yīng)體系如下: 10× T7 RNA Polymerase Buffer 2 μL, 50 mmol/L DTT 2 μL, Dig NTP Mix 2 μL, RNase Inhibitor 0.5 μL, Template DNA (0.5—1 μg) 10 μL, T7 RNA Polymerase (正義探針用SP6 RNA Polymerase 替代即可) 1 μL, RNase-free水2.5 μL, 總體系 20 μL。37℃孵育 3h。加入 2 μL DNaseⅠ (RNase free),混勻后37℃孵育30min。加1.2 μL 4 mol/L LiCl (RNase-free)和37 μL 100%的無水 乙 醇 (RNase-free), –20℃ 沉 淀 過 夜 。 4 ℃, 12000 r/min, 離心20min, 棄上清。加入70%的乙醇(RNase-free)800 μL洗滌沉淀, 來回顛倒EP管使沉淀懸浮, 4 ℃, 12000 r/min,離心5min, 風(fēng)干沉淀。利用 30 μL RNase-free水溶解沉淀, 即為標(biāo)記好的RNA探針, 紫外分光光度計(jì)測定濃度, 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA探針的質(zhì)量, 分裝并于–80℃保存。

茼蒿各采樣植株的葉片綠素a含量、葉綠素b含量及總?cè)~綠素含量和SPAD-502型葉綠素計(jì)測得的SPAD值見表1。

斑馬魚胚胎整體原位雜交 收集剛受精的斑馬魚胚胎, 用郝氏液培養(yǎng)至 6—8 hpf, 再用胰蛋白酶脫掉胚胎膜, 將脫過膜的胚胎用0.06% PTU溶液處理。分別于1—2 cell、6 hpf、12 hpf、24 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf和96 hpf將胚胎或幼魚用4%的多聚甲醛處理固定, 備用于原位雜交。整體原位雜交步驟詳見文獻(xiàn)[27], 采用顯色液(NBT、BCIP、 Alkline Tris buffer)進(jìn)行染色, 顯色完成后, 終止液(20% tween-20、0.5 mol/L EDTA、pH5.5 PBS)和PBST各洗滌3次終止染色, 然后用70%甘油進(jìn)行透化, 置于Leica M165FC體視顯微鏡下觀察拍照。

雙熒光素酶檢測系統(tǒng) 通過對胰外分泌酶原基因基因組序列進(jìn)行分析, 定位基因MARE位點(diǎn)后, 提取斑馬魚基因組 DNA, 并設(shè)計(jì)特異性引物,對胰外分泌酶原基因調(diào)控序列進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增, try基因 RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 63 ℃ 30s; 72 ℃ 2min 。并將目的片段插入PGL3-Promoter載體,陽性克隆送華大基因測序, 測序正確的命名為 try-Promoter。同時(shí)設(shè)計(jì)特異性引物(表1), 構(gòu)建4個(gè)小maf基因的超表達(dá)載體, mafk基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 56 ℃ 30s; 72 ℃ 45s 。mafg1基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 54 ℃ 30s; 72 ℃ 45s 。mafg2基因 RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 58 ℃ 30s; 72℃45s。maft基因RT-PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30s; 58℃30s; 72 ℃ 45s 。將目的片段插入pCS2+載體, 陽性克隆送華大基因測序。用一定劑量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后, 具體步驟參照 Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒和文獻(xiàn)[28], 收集細(xì)胞上清, 檢測熒光素酶活性。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列Tab. 1 Primers used for all the experiments

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚4個(gè)小maf系統(tǒng)進(jìn)化分析

擴(kuò)增得到4個(gè)小maf開放閱讀框全長, 序列比對結(jié)果顯示, 本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到的4個(gè)小maf與NCBI上mafk (NM_001002044.2)、mafg1 (NM_001002045. 3)、mafg2 (NM_212941.1 )和maft (NM_200336.1)序列一致, mafk基因的開放閱讀框包括465個(gè)堿基, 編碼154個(gè)氨基酸; mafg1基因的開放閱讀框包括489個(gè)堿基, 編碼162個(gè)氨基酸; mafg2基因的開放閱讀框包括516個(gè)堿基, 編碼171個(gè)氨基酸; maft基因的開放閱讀框包括477個(gè)堿基, 編碼158個(gè)氨基酸。為了研究小 Maf蛋白的進(jìn)化關(guān)系, 本研究用MEGA5的鄰接法構(gòu)建小 Maf蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹, 并用自展法檢驗(yàn)(圖1)。分析該進(jìn)化樹, 發(fā)現(xiàn)斑馬魚的Mafg1和Mafg2與其他魚類中的Mafg1和Mafg2聚為一支之后, 再與人、小鼠等哺乳動物聚為一支。斑馬魚的Maft先與魚類中Maft聚為一支后, 再與其他哺乳動物的Maff聚為一支的, 支持斑馬魚的maft是maff同源基因。斑馬魚 Mafk 也是如此, 先與魚類中的Mafk 聚為一支以后, 再與其他哺乳動物的聚為一支。最后Mafg、Maff和Mafk三個(gè)分支再歸為一組, 說明這幾類 Maf基因均來源于同一祖先。同時(shí)小 Maf的分子進(jìn)化與物種系統(tǒng)進(jìn)化趨勢一致。

圖 1 小Maf蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic relationship within the small Maf protein family

2.2 斑馬魚4個(gè)小maf染色體線性關(guān)系分析

為了進(jìn)一步探究斑馬魚4個(gè)小maf基因的內(nèi)在聯(lián)系, 本研究對其在不同物種間的線性關(guān)系進(jìn)行分析(圖2)。分析結(jié)果顯示: (1) mafk與lfng、ttyh3、snx8、nudtl、zfand2a、instl、tmen184a、psmg3等基因在斑馬魚、青(Oryzias latipes)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、原雞、牛(Bos Taurus)和人(Homo sapiens)的基因組均位于同一條染色體上(圖2A); (2)maff與tefa、zc3h7b、sh3bp1、cdc42ep1、tnrc6b、csnkle、tmem184b基因在熱帶爪蟾、雞、牛和人的基因組均位于同一條染色體, 而maft與tefa、zc3h7b、sh3bp1、cdc42ep1、tnrc6b、csnkle、tmem184b基因斑馬魚、紅鰭東方基因組也位于同一條染色體(圖 2B), 支持魚類中maft和其他脊椎動物中的maff來源于共同的祖先; (3)mafg1和mafg2與其他基因的同線性明顯比mafk和maff要弱 (圖2A和C)。同時(shí), 魚類中的mafg1和mafk基因總是位于同一條染色體上(圖2A),而mafg2單獨(dú)位于另一條染色體上。 mafg1和mafg2作為 mafg基因在魚類中特有的兩個(gè)旁系同源基因,這種染色體排列關(guān)系是否與基因之間的替換和特有的功能有關(guān), 仍有待于進(jìn)一步研究。

2.3 斑馬魚4個(gè)小maf基因在胚胎發(fā)育時(shí)期中的時(shí)間表達(dá)分析

采用RT-PCR的方法檢測了4個(gè)小maf基因在斑馬魚九個(gè)不同發(fā)育(1—2 cell、3.5 hpf、6 hpf、12 hpf、24 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf和96 hpf)時(shí)期的時(shí)間表達(dá)情況(圖 3)。結(jié)果顯示, 4個(gè)小 maf都是母源性基因, 在胚胎發(fā)育的1—2 cell期就能檢測到表達(dá), 并且4個(gè)小maf在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá), 與原位雜交結(jié)果(圖4)相符。12 hpf以后的表達(dá)模式也與Takagi等[15]的結(jié)果基本一致。

用地高辛標(biāo)記的RNA探針探究斑馬魚10個(gè)不同發(fā)育(1 cell、2 cells、3.5 hpf、6 hpf、12 hpf、24 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf)時(shí)期的空間表達(dá)(圖4)。結(jié)果顯示, 4個(gè)小maf都是母源性基因, 在胚胎發(fā)育1cell期就能檢測到mRNA信號, 4個(gè)小maf在整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)信號外, mafg2和 maft基因在胚胎發(fā)育 72h之后, 在內(nèi)臟消化器官處能看到比較明顯的信號(圖4B、圖4D中箭頭所示), 4個(gè)基因表達(dá)模式基本重合。此外, 值得注意的是, mafg1和mafg2作為mafg基因在魚類中特有的兩個(gè)旁系同源基因, mafg2的表達(dá)量明顯高于mafg1, 與半定量結(jié)果相一致, 即 mafg兩個(gè)拷貝 mafg1和mafg2的表達(dá)量有顯著差異, 24hpg后, mafg2在部分軀干、內(nèi)臟和尾部位有較高表達(dá), 而 mafg1在這些部位幾乎沒有信號。它們表達(dá)模式和表達(dá)量的明顯差異是否與功能的歧化有關(guān), 仍有待于進(jìn)一步研究。

2.5 4個(gè)小Maf參與調(diào)控胰外分泌酶原基因的功能分析

已有研究結(jié)果顯示, Mafk參與調(diào)控胰外分泌酶原基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[22], 但是對其他3個(gè)小Maf是否參與調(diào)控胰外分泌酶原基因的表達(dá)未見報(bào)道, 而小鼠中的研究結(jié)果顯示, 小 MAF之間具有功能疊加和互補(bǔ)作用[24]。所以, 為了探究斑馬魚中的 4個(gè)小Maf, 是否在調(diào)控胰外分泌酶原基因方面具有功能疊加和互補(bǔ)作用, 本研究對4個(gè)小maf構(gòu)建超表達(dá)載體, 并將胰外分泌酶原基因 try基因上游的調(diào)控序列連接到 PGL3-Promoter載體上, 共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞, 通過檢測相對熒光素酶活性來探究因子之間的相互作用。結(jié)果如圖5顯示, 轉(zhuǎn)染100 ng的mafk、mafg1和mafg2質(zhì)粒都使胰外分泌酶原基因try的表達(dá)顯著下調(diào), 而轉(zhuǎn)染100 ng的maft, 胰外分泌酶原基因try的表達(dá)沒有顯著變化, 同時(shí), 本研究還發(fā)現(xiàn), try的表達(dá)對4個(gè)小maf超表達(dá)都具有極顯著或顯著的濃度依賴性, 即小maf超表達(dá)量越高, try的表達(dá)量被抑制得越大。

3 討論

3.1 四個(gè)小maf的表達(dá)模式及分子進(jìn)化關(guān)系

圖2 四個(gè)小maf同線性分析Fig. 2 The synteny of small maf among different species

圖3 RT-PCR分析4個(gè)小maf基因在斑馬魚胚胎不同發(fā)育時(shí)期中的時(shí)間表達(dá)Fig. 3 The expression pattern of small maf in different stages of zebrafish embryogenesis by RT-PCR

小Maf作為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控因子, 參與氧化應(yīng)激反應(yīng)和解毒等多種生命活動[29]。目前, 在斑馬魚中對4個(gè)小maf基因在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式尚未見報(bào)道。本研究利用 RT-PCR和胚胎整體原位雜交技術(shù)對4個(gè)小maf在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行探究, 其半定量和斑馬魚胚胎整體原位雜交結(jié)果顯示: 4個(gè)小maf都是母源性基因。并且在4個(gè)基因中, mafg1的表達(dá)量最低, mafg2的表達(dá)量最高, 其次是maft和mafk基因。魚類中特有的mafg的兩個(gè)拷貝, 即mafg1和mafg2的表達(dá)量有明顯差異, 24 hpf后, mafg2在部分軀干、內(nèi)臟以及尾部仍有較高的表達(dá), 而 mafg1在這些部位基本上沒有表達(dá), 從總體來看, mafg2的表達(dá)量明顯高于mafg1, 這可能與mafg2與其他物種mafg同源性要高于mafg1有關(guān)。mafk基因的表達(dá)部位主要集中在頭部, 部分軀干也有微弱的表達(dá), 發(fā)育后期在軀干部的表達(dá)明顯降低, maft的表達(dá)部位與 mafk相似,在軀干部的表達(dá)較mafk強(qiáng)烈?？偟膩碚f, 4個(gè)小maf的表達(dá)部位基本重疊, 這可能與它們之間可以進(jìn)行功能替換有很大的關(guān)聯(lián)[14,23]。并且有研究表明, 缺失所有3種小maf的小鼠表現(xiàn)為胚胎致死, 所以, 4個(gè)小maf都是斑馬魚母源性基因也從另一方面說明了小maf對斑馬魚的胚胎發(fā)育的重要作用。

本文系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示, 魚類Maft先與其他脊椎動物的Maff歸為一支, 再與Mafk和Mafg分支匯為一組。加上同線性分析結(jié)果, 與魚類maft在同一條染色體的一組基因, 和其他脊椎動物的maff也在同一條染色體上。而且斑馬魚Maft具有Maf類似的功能[15]。從生物信息學(xué)分析和所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, 都支持魚類maft和其他脊椎動物maff是同源基因。因此,作者建議將魚類的maft更名為maff。

小maf基因的同線性分析顯示, mafk和maff基因在物種進(jìn)化過程的保守性較高, 這種保守性也從另一個(gè)方面說明了可能與小maf基因之間存在功能替代有十分重要的關(guān)系, 同時(shí)暗示在生命活動中具有十分重要的作用。

圖4 整體原位雜交檢測4個(gè)小maf mRNA在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)Fig. 4 The spatial-temporal expression patterns of small maf during embryonic development of Danio rerio by whole mount in situ hybridization

圖5 四個(gè)小maf的超表達(dá)對胰外分泌酶原基因try轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)Fig. 5 Overexpression of small maf regulates transcription of try

3.2 四個(gè)小 maf對胰外分泌酶原基因表達(dá)調(diào)控的影響

為了探究斑馬魚中的4個(gè)小maf是否在調(diào)控胰外分泌酶原基因方面具有功能疊加和互補(bǔ)作用, 本研究通過檢測相對熒光素酶活性來探究因子之間的相互作用。研究結(jié)果顯示: 小 maf的超表達(dá)使胰外分泌酶原基因的表達(dá)下調(diào), 結(jié)果與 Igarashi等[23]的研究結(jié)論相符, 即小 maf之間形成同源二聚體時(shí),可抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。雖然胰外分泌酶原基因try的表達(dá)對4個(gè)小maf都具有濃度依賴性, 但其抑制能力有差異, mafg1和mafg2在低濃度(100 ng轉(zhuǎn)染量)時(shí)對try表達(dá)的抑制能力顯著高于mafk和mafgt, 并且maft在低濃度(100 ng轉(zhuǎn)染量)時(shí)對try表達(dá)的沒有顯著影響。總之, 這4個(gè)小maf可能都參與胰外分泌酶原基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 不過對于其功能疊加和互補(bǔ)作用仍有待于進(jìn)一步研究。

以上結(jié)果表明, 4個(gè)小maf基因都是母源性基因,并且可能都參與了調(diào)控胰外分泌酶原基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 本研究結(jié)果將為深入研究小 maf基因的功能及其分子歧化積累了數(shù)據(jù)。

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THE SPATIAL-TEMPORAL EXPRESSION PATTERNS OF SMALL MAF AND THEIR EFFECTS ON THE REGULATION OF ZYMOGENS IN ZEBRAFISH

ZENG Qiao-Hui, WU Chun, LU Fei, ZHAO Hao-Bing, ZHONG Xue-Ping and ZHOU Qing-Chun
(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology & School of Life Sciences, Huazhong Normal University, Wuhan 430079, China)

The members of musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene (Maf) family are important transcription factors that are involved in many cascades of cell biology. They are classified into large and small Maf proteins. The small Maf proteins of zebrafish include Mafk, Mafg1, Mafg2 and Maff (Maft). Mafg1 and mafg2 are paraloges of mafg that only exist in fish genomes. The phylogenetic tree indicated that the evolution of the small Mafs was conservative. The systemic analyses of different small mafs also showed that mafk and maff were more conservative than mafg. In the present study we analyzed the spatial-temporal expression of these four mafs in the early development of zebrafish embryos using semiquantitative PCR and whole mount in situ hybridization. The expression of all four genes started at the one cell stage, suggesting that these genes were maternal and the expression were ubiquitous in early zebrafish embryos. Mafg2 showed the highest expression level among the four genes, and was specifically expressed in blood circulation after 48 hpf, together with maff. The results of dual-luciferase system also showed that the over expression of the four small Mafs led to down-regulation of the transcription of zymogens in a dose-dependent manner. Our study should contribute to better understanding of the functional superposition and complementarities of small Mafs.

Zebrafish; maf; Whole-mount in situ hybridization of zebrafish; Zymogens

Q344+.1

A

1000-3207(2015)03-0449-10

10.7541/2015.60

2014-06-18;

2014-08-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071997和30972254)資助

曾俏慧(1989—), 女, 湖南省邵陽市人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)閯游飳W(xué)。E-mail: wszqha1989@163.com

周青春, E-mail: qczhou@mail.ccnu.edu.cn