裴永艷黃 容李勇明廖蘭杰朱作言汪亞平

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

魚(yú)類(lèi)和哺乳類(lèi)TLR4基因結(jié)構(gòu)和功能的保守與進(jìn)化

裴永艷1,2黃 容1李勇明1廖蘭杰1朱作言1汪亞平1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

先天性免疫是生物體第一道免疫防線, 存在于各種多細(xì)胞生物中。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)病原體相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)識(shí)別的一類(lèi)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PPRs), 在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4是toll家族成員之一, 哺乳類(lèi)中主要負(fù)責(zé)識(shí)別細(xì)菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。文章就TLR4的發(fā)現(xiàn)歷史, TLR4在魚(yú)類(lèi)和哺乳類(lèi)中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn), TLR4的分布特征, 魚(yú)類(lèi)和哺乳類(lèi)中TLR4識(shí)別配體的差異, TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)以及TLR4的進(jìn)化進(jìn)行了綜述。綜述將對(duì)TLR相關(guān)研究提供借鑒和參考。

TLR4; 信號(hào)通路; 脂多糖; 進(jìn)化

生物體每時(shí)每刻都受到各種病原微生物的感染,在一般情況下生物體的免疫系統(tǒng)可以發(fā)揮作用清除這些病原微生物。生物的免疫系統(tǒng)包括兩種類(lèi)型,即先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫是生物體第一道免疫防線, 存在于各種多細(xì)胞生物中[1]。當(dāng)病原體侵入生物體后, 先天性免疫系統(tǒng)可以通過(guò)多種模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)識(shí)別病原體的一些非特異性的、高度保守且對(duì)生存和致病性必要的分子結(jié)構(gòu), 比如內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、未甲基化的多聚CpG核苷酸、鞭毛、雙鏈RNA和肽聚糖等。這種來(lái)自細(xì)菌或病毒的特定的結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為病原體相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)[2—4]。然后, 生物體產(chǎn)生迅速有效的免疫反應(yīng), 清除病原體, 同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)PAMPs識(shí)別的一類(lèi)PRRs, 在先天性免疫中發(fā)揮了重要的作用[5,6]。Toll樣受體最先在果蠅中被發(fā)現(xiàn), 并且在果蠅早期胚胎的背腹極性的形成中起重要作用[7]。不同的生物中至少存在15種TLRs, 包括TLR1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11/12、13、14、21和TLR22/23[7]。其中, 人類(lèi)的 TLR4是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被鑒定的TLR受體, 同時(shí)是果蠅TLR1的直系同源基因[8]。在哺乳動(dòng)物中, TLR4是LPS主要識(shí)別受體, 在機(jī)體炎癥反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。TLR4是研究較為深入的TLR家族成員。本文就其從哺乳類(lèi)TLR4到魚(yú)類(lèi)TLR4發(fā)現(xiàn)歷史及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、TLR4的配體識(shí)別及信號(hào)通路和 TLR4的功能進(jìn)化研究等方面綜述如下。

1 TLR4的發(fā)現(xiàn)

1980年, Nusslein-Volhard等首先命名了Toll基因[9], 1984年Steward等研究黑腹果蠅胚胎極性形成時(shí)發(fā)現(xiàn)一種Toll蛋白能夠影響背腹軸極性的形成[10], 1985年, Anderson等在果蠅中克隆了Toll基因[11]。1991年, Gay等發(fā)現(xiàn), Toll蛋白在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物中一種天然免疫功能分子—白細(xì)胞介素受體(Interleukon-1, IL-1)具有同源性, 二者的胞內(nèi)區(qū)部分結(jié)構(gòu)上相似[12], 暗示了 Toll可能和免疫有關(guān)。1994年, Nomura等報(bào)道了人類(lèi)的第一個(gè) TLR[13]。1996年, Taguchi等將其定位在 4號(hào)染色體上[14]。Lemaitre等發(fā)現(xiàn)果蠅中的Toll在抗真菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用, 它能促進(jìn)抗菌肽的合成[15]。1997年, Medzhitov等首次發(fā)現(xiàn)與果蠅Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因及其編碼的 Toll樣受體蛋白, 即如今的TLR4蛋白。TLR4與配體結(jié)合后, 能誘導(dǎo)一些關(guān)鍵基因的表達(dá), 從而激活獲得性免疫反應(yīng)[8]。對(duì)TLR4突變和缺失的小鼠研究發(fā)現(xiàn)TLR4是LPS的主要識(shí)別受體[16—18]。Leveque等克隆了雞的TLR4, 發(fā)現(xiàn)其對(duì)沙門(mén)氏菌有抵制作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)13號(hào)染色體上存在3個(gè)TLR4同源基因[20—22]。Huang等發(fā)現(xiàn)草魚(yú)中存在一個(gè)TLR4基因簇, 其包含4個(gè)TLR4基因, 它們對(duì) LPS沒(méi)有明顯的響應(yīng)而對(duì)病毒具有一定程度的響應(yīng)[23]。

2 TLR4在不同物種中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

TLRs家族為I型跨膜蛋白, 家族中各個(gè)成員的蛋白結(jié)構(gòu)基本相似, 均包括 3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域: (1)胞外區(qū), (2)跨膜區(qū), (3)胞內(nèi) Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR)。胞外區(qū)由 19—25個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列(Leucine-rich repeat, LRR)組成, 每個(gè) LRR有 24—29個(gè)氨基酸,包含一個(gè)保守的 XLXXLXLXX模塊和一個(gè)保守的X?XX?XXXXFXXLX模塊(X為任意氨基酸, ?為疏水性氨基酸), 折疊形成馬蹄形結(jié)構(gòu)。同時(shí), 這個(gè)區(qū)包含一個(gè)配體結(jié)合區(qū)域(Ligand Binding Region, LBR)可以直接識(shí)別PAMPs。該區(qū)域受到進(jìn)化的選擇,具有較大的變異性, 從而適應(yīng)不同的配體分子[24]。胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域序列與白細(xì)胞介素1受體1L-1R家族的胞質(zhì)區(qū)序列有高度同源性, 兩者的分子構(gòu)象也很相似[25,26], TIR結(jié)構(gòu)域高度保守, 功能是信號(hào)傳導(dǎo)[27]。

TLR4在哺乳動(dòng)物中同樣具有這三個(gè)結(jié)構(gòu)域,然而在魚(yú)類(lèi)中卻發(fā)生了變化。在草魚(yú)中, 存在的 4個(gè) TLR4s(CiTLR4.1、 CiTLR4.2、CiTLR4.3、CiTLR4.4), 其中 CiTLR4.2、CiTLR4.3、CiTLR4.4是典型的TLRs, 包含 LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和TIR結(jié)構(gòu)域。但是, 與這3個(gè)基因相比, CiTLR4.1的DNA序列有207 bp的缺失, 導(dǎo)致翻譯的蛋白只有LRR結(jié)構(gòu)域, 沒(méi)有跨膜區(qū)和胞內(nèi) TIR結(jié)構(gòu)域。此外幾乎所有的哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的TLRs都有完整的信號(hào)肽區(qū)域,然而斑馬魚(yú)和草魚(yú)的TLR4s則有所不同。斑馬魚(yú)的DrTLR4ba1以及草魚(yú)的 CiTLR4.1、CiTLR4.2沒(méi)有信號(hào)肽序列[23]。

3 TLR4的分布特征

TLRs家族廣泛分布于各種免疫細(xì)胞中, 包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、特定類(lèi)型的T淋巴細(xì)胞, 此外還分布在一些非免疫細(xì)胞中如上表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中。TLR4同樣存在于各種免疫細(xì)胞中, 在部分組織細(xì)胞如人角膜上皮細(xì)胞中也有表達(dá)[28,29]。斑馬魚(yú)的 3個(gè) TLR4基因中, 有兩個(gè)(DrTLR4ba1、DrTLR4bb)表達(dá)模式已報(bào)道過(guò), DrTLR4ba1在血液、腸、精巢、皮膚、腦、肝臟、心臟中均有表達(dá), 而 DrTLR4bb僅僅在皮膚和心臟中表達(dá)[20]。草魚(yú)中四個(gè) TLR4s分布于多個(gè)組織中,如腦、心臟、肌肉、肝臟、腎臟等[23]。

4 TLR4的配體識(shí)別差異

在TLRs家族中, 根據(jù)識(shí)別的配體不同將TLRs分為兩個(gè)亞類(lèi), 第一個(gè)亞類(lèi)包括TLR1、2、4、5、6和TLR10, 這些TLRs存在于細(xì)胞膜的表面, 主要結(jié)合細(xì)菌表面的PAMPs, 如肽聚糖、脂多糖和鞭毛等,它們被稱(chēng)作識(shí)別細(xì)菌的 TLRs[30—36]。第二個(gè)亞類(lèi)包括TLR3、7、8和TLR9, 它們存在于細(xì)胞內(nèi)體上, 主要識(shí)別病毒相關(guān)的PAMPs, 如未甲基化的多聚CpG核苷酸、雙鏈 RNA等, 它們被稱(chēng)作識(shí)別病毒的TLRs[30—36]。

在哺乳動(dòng)物中TLR4識(shí)別的配體包括外源性配體如LPS和由于細(xì)胞損傷生成的內(nèi)源性物質(zhì)如高遷移率族蛋白 B1(High mobility group protein B1, HMGB1)、透明質(zhì)酸和二聚糖等[37,38]。LPS是G-細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分, 結(jié)構(gòu)上由類(lèi)脂 A、核心多糖和O-特異側(cè)鏈3部分組成。類(lèi)脂A主要激活哺乳動(dòng)物先天性免疫反應(yīng)及賦予LPS內(nèi)毒素毒性[39]。此外, 在魚(yú)類(lèi)中有些種類(lèi)的LPS對(duì)機(jī)體起到免疫保護(hù)作用[40]。

由于TLR2和TLR4在對(duì)LPS響應(yīng)的細(xì)胞中如外周血白細(xì)胞, 巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的高度表達(dá), TLR2一度被認(rèn)為是識(shí)別LPS的主要受體[41]。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) TLR4才是 LPS主要識(shí)別受體。Poltorak等報(bào)道了LPS耐受的C3H/HeJ小鼠是由于TLR4基因突變引起的; LPS耐受的C57BL/10ScCr小鼠中不存在TLR4mRNA的表達(dá)[16]。Hoshino等發(fā)現(xiàn)TLR4缺陷的小鼠對(duì)LPS沒(méi)有反應(yīng)[18]。此外, Kawata等發(fā)現(xiàn)一種脂多糖抑制劑阻止外源導(dǎo)入 TLR4的細(xì)胞對(duì)LPS的響應(yīng)[42]。Chow等通過(guò)NF-кB雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)指出TLR4介導(dǎo)了LPS的信號(hào)傳導(dǎo)[17]。

TLR4不能像大部分TLRs那樣能夠直接識(shí)別相應(yīng)配體[43,44]。在哺乳動(dòng)物中, TLR4識(shí)別 LPS需要LBP、CD14和MD-2的輔助。LBP是一種可溶性的蛋白, 能直接結(jié)合LPS, 從而促進(jìn)LPS與CD14的結(jié)合。CD14是糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白, 也可以以可溶性的形式存在, 它的功能是把 LPS轉(zhuǎn)移給TLR4/MD-2受體復(fù)合物[45]。LPS與TLR4相互作用之前需要先結(jié)合輔助受體MD-2, 即LPS結(jié)合MD-2的疏水區(qū), 誘導(dǎo)TLR4/MD-2二聚化, 最終激活信號(hào)通路[43,44]。MD-2是可溶性的糖蛋白, 與TLR4非共價(jià)結(jié)合, 它還具有單獨(dú)同LPS結(jié)合的能力[45]?？偠灾? LBP與LPS結(jié)合, 并將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面, 與CD14形成三元復(fù)合物, 然后將 LPS傳遞給 TLR4/ MD-2受體復(fù)合物從而誘導(dǎo)下游的信號(hào)通路[46]。TLR4不能直接與LPS接合, 必須依賴(lài)于MD-2。

較低等的脊椎動(dòng)物特別是魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)對(duì) LPS的毒性反應(yīng)有耐受力[47]。相對(duì)于哺乳動(dòng)物而言, 在體外實(shí)驗(yàn)中需要使用極高濃度的LPS刺激不同魚(yú)類(lèi)的白細(xì)胞才能達(dá)到預(yù)期的效果[48—52]。用LPS刺激斑馬魚(yú), 其TLR4基因的表達(dá)沒(méi)有響應(yīng), 推測(cè)斑馬魚(yú)體內(nèi)識(shí)別LPS不是通過(guò)TLR4介導(dǎo)的。另外, 斑馬魚(yú)的TLR4s對(duì)熱滅活大腸埃希氏菌和熱滅活的嗜肺軍團(tuán)菌也沒(méi)有響應(yīng)。然而將斑馬魚(yú) TLR4的跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)融合到小鼠TLR4的胞外區(qū)后的嵌合分子可以激活NF-кB的反應(yīng), 證明斑馬魚(yú)TLR4缺乏識(shí)別LPS的能力是由于斑馬魚(yú) TLR4s胞外區(qū)沒(méi)有識(shí)別LPS的能力, 而不是由于其 TIR結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)能力的改變。這同時(shí)反駁了之前報(bào)道的斑馬魚(yú) TLR4s的 TIR區(qū)負(fù)調(diào)節(jié) NF-кB的說(shuō)法, 證實(shí)了魚(yú)類(lèi)中的TLR4與LPS的識(shí)別無(wú)關(guān)并且可能存在另一種LPS識(shí)別途徑的假說(shuō)[53]。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)對(duì)LPS具有耐受性, 可能由于斑馬魚(yú) TLR4信號(hào)傳導(dǎo)中MyD88上游的接頭分子TIRAP蛋白N端比哺乳動(dòng)物多了 105個(gè)氨基酸的原因[54]。然而, 在河豚中的研究顯示了清道夫受體SR代替了TLR4識(shí)別LPS,同時(shí)參與NF-κB的負(fù)調(diào)節(jié), 魚(yú)類(lèi)中是否普遍存在這樣的現(xiàn)象, 有待深入研究[55]。

哺乳動(dòng)物的呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)的融合蛋白和LPS一樣, 能通過(guò)TLR4途徑激活細(xì)胞免疫反應(yīng)[56,57]。小鼠乳腺腫瘤病毒(Mouse mammary tumor virus, MMTV)則能與小鼠TLR4免疫共沉淀, 它們的結(jié)合能激活B細(xì)胞免疫反應(yīng)[58]。

用草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)攻毒處理稀有鯽 36h后, 稀有鯽 TLR4b基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)了5倍[59]。GCRV感染草魚(yú)后, CiTLR4.3和CiTLR4.4在肝臟和肌肉中的表達(dá)量都逐漸增加, 并且4個(gè)TLR4基因mRNA表達(dá)水平都有明顯上調(diào)的趨勢(shì)[23]。以上結(jié)果暗示了TLR4在魚(yú)類(lèi)中可能與病毒的識(shí)別相關(guān)。

5 TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)

TLRs識(shí)別受體后并與之結(jié)合, 同時(shí)自身二聚化, 并通過(guò)其胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域募集其他含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子, 如 MyD88、TIRAP(也稱(chēng)為 Mal)、TRIF(也稱(chēng)為T(mén)ICAM1)和TRAM(也稱(chēng)為T(mén)ICAM2)。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR11能夠募集MyD88。除了募集MyD88外, TLR1、TLR2、TLR4和TLR6還能夠募集TIRAP, TIRAP的功能是介導(dǎo)TLRs與MyD88的連接。TLR3和 TLR4能夠募集 TRIF, 另外, TLR4還能夠集TRAM, TRAM的功能是介導(dǎo)TLR4與TRIF的連接[60]。上述的這些募集分子歸到兩條信號(hào)通路中, 一條信號(hào)通路是依賴(lài)MyD88的信號(hào)通路, 即依賴(lài)于MyD88和TIRAP誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)因子IL-1和TNFα的表達(dá)[61,62]。另一條是非依賴(lài)于 MyD88的信號(hào)通路, 即依賴(lài)于TRIF和TRAM來(lái)激活NF-кB和抗病毒的I型IFN的反應(yīng)[62,63]。在TLRs家族中, 大部分TLRs成員是依賴(lài)于MyD88的信號(hào)通路, 而TLR3只有非依賴(lài)于MyD88的信號(hào)通路, TLR4是唯一擁有兩條信號(hào)通路的TLRs成員[63,64]。

在哺乳動(dòng)物中, 對(duì)于依賴(lài)于MyD88的途徑, 當(dāng)LPS的信號(hào)作用于TLR4時(shí), TLR4的胞內(nèi)區(qū)與一個(gè)接頭分子MyD88的同源結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。MyD88包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域, 與 Toll受體同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合的羧基末端和包含死亡結(jié)構(gòu)域的氨基末端[63—65]。該死亡結(jié)構(gòu)域與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶 4(IL-1 receptor-associated kinase, IRAK)的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用引起 IRAK4磷酸化下游的激酶 IRAK1。磷酸化的IRAK1募集并激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TNF-receptor-associated factor 6,TRAF-6)[66]。這一因子反過(guò)來(lái)又結(jié)合并激活 TAB1/TAK1/TAB2復(fù)合物。TAK1磷酸化NF-кB抑制劑(IкB)的激酶(IKK),然后活化的IKK再磷酸化IкB, 最終導(dǎo)致IкB泛素化而降解[67], 從而使NF-кB從抑制狀態(tài)下被激活。細(xì)胞質(zhì)中游離的NF-кB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核, 其活性二聚體啟動(dòng)細(xì)胞因子如 IL-1的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于非依賴(lài)于MyD88的途徑, 當(dāng) LPS的信號(hào)作用于 TLR4時(shí), TLR4募集TRIF、TRAM兩個(gè)接頭分子, TBK1磷酸化 IKK, 激活干擾素調(diào)節(jié)因子 IRF3, 使其二聚化并移位到細(xì)胞核, 誘導(dǎo)I型IFN, IFN-β的表達(dá)[64,68—70]?？傊? TLR4信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要激活轉(zhuǎn)錄因子NF-кB、IRF3等, 最后誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)(圖1)。

圖1 哺乳動(dòng)物中TLR4信號(hào)通路Fig. 1 TLR4signal transduction pathway

6 TLR4的功能進(jìn)化研究

雖然之前認(rèn)為脊椎動(dòng)物TLRs在進(jìn)化上很保守[31],然而一些物種如鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中的 TLRs并不如預(yù)期的保守, 它們經(jīng)歷了一定的進(jìn)化上的正向選擇[71,72]。一般情況下, TLRs的LRR區(qū)比TIR區(qū)進(jìn)化速率要快。在TLRs家族中, TLR3和TLR7的LRR區(qū)進(jìn)化速率最低, 它們可能代表了先天性免疫系統(tǒng)中一種保守的機(jī)制和結(jié)構(gòu)。然而, 在TLR10中, LRR區(qū)進(jìn)化速率卻低于 TIR區(qū), 這說(shuō)明它的信號(hào)傳導(dǎo)功能可能不同于其他TLRs[73]。此外, 嚙齒目TLR4和TLR7經(jīng)歷了正向選擇, 并且TLR4比TLR7的進(jìn)化速度要快, TLR4的胞外區(qū)的LBR具有可變性, 這與其識(shí)別的配體種類(lèi)的多樣性有關(guān)[74]。

TLRs家族的成員隨著脊椎動(dòng)物的產(chǎn)生而不斷增加, 然而多樣性隨著脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的完善而逐漸降低。線蟲(chóng)中有 1個(gè) TLR[75], ?？杏?1個(gè)TLRs[76], 海膽中有 2個(gè) TLRs[77], 海鞘中有 3個(gè)TLRs[78], 而作為圓口類(lèi)七鰓鰻的 TLRs成員卻高達(dá)16個(gè)[79]。硬骨魚(yú)類(lèi)的TLRs則具有更高的多態(tài)性, 硬骨魚(yú)中總共發(fā)現(xiàn)18種類(lèi)型的TLRs(TLR1、2、3、4、5、7、8、9、14、16、18、19、20、21、22、23、25、26)[80]。魚(yú)類(lèi)中的TLRs還存在旁系同源基因, 如斑馬魚(yú)共有21個(gè)TLRs成員, 其中的TLR4有3個(gè)旁系同源基因, TLR5有2個(gè), TLR8有2個(gè), TLR20有 6個(gè)[21], 其他魚(yú)類(lèi)中也有相類(lèi)似的報(bào)道。而在人和小鼠中僅發(fā)現(xiàn)了13個(gè)TLRs[31]。以上現(xiàn)象說(shuō)明隨著獲得性免疫系統(tǒng)的不斷完善并在免疫系統(tǒng)中逐漸占據(jù)核心地位, 作為模式識(shí)別受體的 TLRs因?yàn)楣δ苌系娜哂喽饾u丟失。

脊椎動(dòng)物的TLRs主要分為14個(gè)分支, 各個(gè)物種擁有的不同的TLRs分支, 但每種TLRs分支只有一個(gè)拷貝[7]。TLR4在人和小鼠中只有一個(gè)拷貝。然而魚(yú)類(lèi)中 TLR4的現(xiàn)象比較復(fù)雜, 在稀有鯽中現(xiàn)已報(bào)道了一個(gè) TLR4[59], 斑點(diǎn)叉尾中存在兩個(gè)TLR4(TLR4/TLR4S)[80], 在斑馬魚(yú)基因組中卻發(fā)現(xiàn)了三個(gè)TLR4(DrTLR4ba1、DrTLR4ba2和DrTLR4bb),草魚(yú)基因組中存在4個(gè)TLR4(CiTLR4.1、CiTLR4.2、CiTLR4.3和CiTLR4.4)[23]。在河豚、東方紅鰭豚、淡水豚和刺魚(yú)基因組中卻沒(méi)檢測(cè)到TLR4[81,82]。以上現(xiàn)象都說(shuō)明了魚(yú)類(lèi)TLR4基因在進(jìn)化上非?；钴S[23]。共線性和進(jìn)化樹(shù)分析顯示斑馬魚(yú)的 TLR4與人的TLR4是旁系同源, 而非直系同源[81], 這說(shuō)明魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物分支后, TLR4發(fā)生了變化。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 斑馬魚(yú)TLR4s與小鼠、人和雞TLR4s聚為一支而與其他TLR4s分開(kāi)。草魚(yú)和斑馬魚(yú)的TLR4s首先聚在一起, 再與哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)的TLR4s聚在一起[23]。斑馬魚(yú)和草魚(yú)共同的祖先很可能是2個(gè)TLR4基因, 其中一個(gè)分化成斑馬魚(yú)的 DrTLR4bb和草魚(yú)的CiTLR4.4, 另一個(gè)則通過(guò)1次復(fù)制分化成斑馬魚(yú)的DrTLR4ba和LOC795671, 通過(guò)2次復(fù)制分化成草魚(yú)的CiTLR4.1、CiTLR4.2、CiTLR4.3[23]。研究顯示河豚中的TLR4基因的丟失是由于清道夫受體SR代替了TLR4基因識(shí)別LPS[55]。斑馬魚(yú)基因組TLR4基因的保留可能是由于通過(guò)TLR4或其他TLR的亞功能化和新功能化使得 TLR4基因的存在是不可或缺的[22]。

斑馬魚(yú)TLR4對(duì)LPS的刺激沒(méi)有反應(yīng), Sepulcre等基于雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析斑馬魚(yú)的整個(gè)胚胎,指出了TLR4在LPS信號(hào)傳導(dǎo)中作用的另一種觀點(diǎn): TLR4負(fù)調(diào)控MyD88依賴(lài)性的TLR途徑[83]。后來(lái)研究反駁了這個(gè)觀點(diǎn)并證實(shí)斑馬魚(yú)TLR4缺乏識(shí)別LPS的能力是由于斑馬魚(yú) TLR4s胞外區(qū)沒(méi)有識(shí)別LPS的能力[82]。較低等的脊椎動(dòng)物特別是魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)對(duì)LPS的毒性反應(yīng)有耐受力[47]。相對(duì)于哺乳動(dòng)物而言, 在體外實(shí)驗(yàn)中需要使用極高濃度的LPS刺激不同魚(yú)類(lèi)的白細(xì)胞才能達(dá)到預(yù)期的效果[48—52],似乎只有高等的脊椎動(dòng)物對(duì)低劑量的LPS才有典型的TLR4依賴(lài)的免疫反應(yīng)[84]。這支持了TLR4識(shí)別LPS發(fā)生在魚(yú)類(lèi)和四足動(dòng)物分支之后這個(gè)假說(shuō)[83]。

7 小結(jié)與展望

在哺乳動(dòng)物特別是人類(lèi)中, 由于 TLR4可以識(shí)別LPS, 參與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并和許多疾病如腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化及哮喘關(guān)系密切, 有關(guān) TLR4的功能研究的很透徹。然而, 由于魚(yú)類(lèi)中 TLR4發(fā)現(xiàn)比較晚, 存在TLR4的物種也比較少, 所以TLR4的功能目前還不是很確定。

在哺乳動(dòng)物中TLR4是LPS的主要受體, 可以通過(guò)CD14和MD-2的協(xié)同作用介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[45,46]。TLR4或MD-2缺失的小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)LPS的刺激無(wú)響應(yīng), TLR4/MD-2復(fù)合物是識(shí)別LPS的唯一受體[85]。在魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)LPS并沒(méi)有誘導(dǎo)TLR4的高表達(dá), 魚(yú)類(lèi)現(xiàn)有的基因組類(lèi)和EST序列中均不存在CD14和MD-2[22,84]。這說(shuō)明魚(yú)中TLR4可能無(wú)法識(shí)別LPS或依賴(lài)于另一種受體識(shí)別LPS。在草魚(yú)和稀有鯽中, 發(fā)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)了 TLR4的表達(dá)[23,59],這說(shuō)明在魚(yú)類(lèi)中TLR4的功能可能是識(shí)別病毒而不是 LPS, 其識(shí)別的配體還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。TLR4對(duì)LPS的識(shí)別可能是在魚(yú)類(lèi)和四足動(dòng)物分支以后形成的。此外, 魚(yú)類(lèi)與哺乳動(dòng)物的 TLR4結(jié)構(gòu)也存在差異。魚(yú)類(lèi)中不同TLR4拷貝的功能比較研究也將為其他TLR在物種進(jìn)化過(guò)程中的功能進(jìn)化研究提供更多線索。

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CONSERVATIVE AND EVOLUTION OF TLR4’S GENE STRUCTURE AND FUNCTION IN FISH AND MAMMALIAN

PEI Yong-Yan1,2, HUANG Rong1, LI Yong-Ming1, LIAO Lan-Jie1, ZHU Zuo-Yan1and WANG Ya-Ping1
(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Innate immunity is the first defense of organisms, which exist in all kinds of multicellular organism. Toll-like receptors (TLRs) is aclass of Pattern recognition receptors (PRRs) that involved in the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and played an important role in innate immunity. In regard to TLR4, which is a member of TLRs and could recognize the lipopolysaccharide (LPS) in bacterial. In the study, the found history of TLR4, structural features of TLR4 in mammalians and fish, distribution of TLR4, difference of TLR4 in mammalians and fish, signaling transmission, and the evolution of TLR4 were reviewed. This summary in the study would provide a reference for the research of TLR.

TLR4; Signal transduction pathway; LPS; Evolution

Q342+.4

A

1000-3207(2015)03-0590-08

10.7541/2015.77

2014-01-24;

2014-12-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31130055, 31123001)資助

裴永艷(1989—), 女, 江蘇省宿遷人; 博士; 主要從事魚(yú)類(lèi)抗病基因的功能研究。E-mail: callmepyy@126.com

汪亞平(1963—), 男, 研究員; 研究方向?yàn)轸~(yú)類(lèi)功能基因組學(xué)、魚(yú)類(lèi)分子育種等。E-mail: wangyp@ihb.ac.cn