楊慧萍，馬清義，高　睿（.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌700；.陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心，陜西周至7040）

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大熊貓?jiān)措p歧桿菌分離株的培養(yǎng)特性及藥敏試驗(yàn)

楊慧萍1，馬清義2，高睿1
（1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心，陜西周至710402）

摘 要：雙歧桿菌的培養(yǎng)特性和藥敏試驗(yàn)是研究雙歧桿菌微生態(tài)制劑的基礎(chǔ)。從大熊貓新鮮糞便中分離的兩株雙歧桿菌進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)及耐溫馴化等研究發(fā)現(xiàn)，改良肉湯培養(yǎng)基是雙歧桿菌大熊貓分離株體外增殖理想的培養(yǎng)基；2個(gè)雙歧桿菌大熊貓分離株均對(duì)紅霉素、氯霉素等敏感，對(duì)青霉素等產(chǎn)生較高的耐藥性；在較高溫度下雙歧桿菌大熊貓分離株能迅速地增殖，代謝能力大為提高，并與其他乳酸菌協(xié)同發(fā)酵，抑制致病菌的生長(zhǎng)。雙歧桿菌大熊貓分離株在體外生長(zhǎng)良好，不是廣譜的耐藥菌株。

關(guān)鍵詞：大熊貓雙歧桿菌培養(yǎng)特性藥敏試驗(yàn)

大熊貓作為動(dòng)物的“活化石”，在地球上至少已存活了800萬年，是我國(guó)特有的珍稀動(dòng)物，被譽(yù)為“國(guó)寶”，然而由于其食物單調(diào)，數(shù)量稀少、繁殖率低下、疾病等原因使得大熊貓瀕臨滅絕，為了保護(hù)這一瀕危動(dòng)物，國(guó)家建立了很多自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行人工飼養(yǎng)［1］。飼養(yǎng)過程中腸道疾病是引起大熊貓死亡的主要原因，而腸道菌群失衡導(dǎo)致胃腸道功能紊亂又是引起大熊貓腸道疾病的主要原因，因此應(yīng)用雙歧桿菌制劑調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，對(duì)防治大熊貓腸道疾病，保護(hù)這一瀕危物種有著非常重要的意義［2］。目前，雙歧桿菌制劑的研究主要集中在食品、人的保健、醫(yī)療、養(yǎng)殖等領(lǐng)域［3-7］，大熊貓雙歧桿菌制劑的研究幾乎是個(gè)空白，本試驗(yàn)對(duì)從大熊貓新鮮糞便中分離的雙歧桿菌的培養(yǎng)特性、藥敏試驗(yàn)及耐溫馴化等進(jìn)行研究，以期為雙歧桿菌制劑應(yīng)用于大熊貓腸道疾病的防治提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及培養(yǎng)基 兩歧雙歧桿菌和最小雙歧桿菌，從人工飼養(yǎng)的健康大熊貓新鮮糞便中按照常規(guī)細(xì)菌分離方法分離得到。普通肉湯，改良肉湯，厭氧肉肝湯，牛乳培養(yǎng)基。

1.1.2主要儀器及試劑 高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；冰箱，海爾集團(tuán)生產(chǎn)。焦性沒食子酸，由衢州明鋒化工有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)100316。氫氧化鈉，由滄州隆昌化工有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)090817。標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物紙片，由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。脫脂奶粉，由中國(guó)陜西和氏乳品有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng) 取分離的雙歧桿菌接種于血瓊脂平板、普通肉湯、厭氧肉肝湯和改良肉湯培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h取出，觀察其在血瓊脂平板上的菌落形態(tài)、進(jìn)行革蘭染色后顯微觀察細(xì)菌形態(tài)、觀察其在三種不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，并記錄結(jié)果。

1.2.2藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采取紙片瓊脂擴(kuò)散法。用滅菌棉簽將兩株雙歧桿菌肉湯培養(yǎng)物均勻地涂抹于普通瓊脂平板上，用消過毒的鑷子將標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物紙片貼壓于普通平板上，整個(gè)操作在無菌間進(jìn)行，然后放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后取出，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.3耐溫馴化 將兩株雙歧桿菌分別接種于牛乳培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，待凝乳后轉(zhuǎn)接于另一只牛乳培養(yǎng)基中，38℃培養(yǎng)，如此逐漸遞增至42℃。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌培養(yǎng)

顯微鏡觀察分離的雙歧桿菌為G+桿菌，呈分支狀，單生、柵欄狀、“V”字形或“Y”字形排列，菌落為小菌落，邊緣整齊，隆起，灰白色，不透明，表面光滑。分離的雙歧桿菌在改良肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，其中細(xì)菌含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外兩種培養(yǎng)基。

2.2藥敏試驗(yàn)

本次藥敏試驗(yàn)的結(jié)果為，兩歧雙歧桿菌對(duì)頭孢唑啉、先鋒塞肟、鏈霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、萬古霉素、四環(huán)素、卡那霉素及丁氨卡那霉素高敏，對(duì)慶大霉素中度敏感，對(duì)青霉素、氨芐青霉素、妥布霉素及諾氟沙星耐藥；最小雙歧桿菌對(duì)頭孢唑啉、先鋒塞肟、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、丁氨卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素及諾氟沙星高敏，對(duì)萬古霉素中度敏感，對(duì)青霉素、氨芐青霉素及復(fù)方新諾明耐藥（表1和表2）。

2.3耐溫馴化

兩歧雙歧桿菌在39℃之后凝乳時(shí)間加快，最小雙歧桿菌凝乳時(shí)間平穩(wěn)縮短，但兩者在42℃時(shí)均縮短到3h～5h。

表1　雙歧桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果（mm）Table 1 The results of drug susceptibility tests of Bifidobacterium

3　討論

雙歧桿菌為專性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，對(duì)氧氣、溫度等極為敏感，在體外培養(yǎng)比較困難，所以研究適合雙歧桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基非常重要［8］。本試驗(yàn)選用了普通肉湯、厭氧肉肝湯、改良肉湯培養(yǎng)基對(duì)雙歧桿菌大熊貓分離株進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在改良肉湯培養(yǎng)基中其生長(zhǎng)良好，細(xì)菌含量達(dá)到109CFU/mL以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外兩種培養(yǎng)基，因此初步認(rèn)為改良肉湯培養(yǎng)基是雙歧桿菌大熊貓分離株體外增殖較為理想的培養(yǎng)基。由于針對(duì)雙歧桿菌大熊貓分離株體外增殖條件的研究較少，因此適用于其生長(zhǎng)的溫度、pH、培養(yǎng)基的炭源、氮源、生長(zhǎng)因子等條件的選擇還需要作進(jìn)一步的研究。

表2　雙歧桿菌的藥敏性Table 2 Results of drug susceptibility of Bifidobacterium

有文獻(xiàn)報(bào)道，雙歧桿菌對(duì)青霉素、萬古霉素、紅霉素等高敏，所有菌株均對(duì)氯霉素敏感［9］。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的兩株雙歧桿菌均對(duì)紅霉素、氯霉素等敏感，對(duì)青霉素等產(chǎn)生耐藥性，這與魏亞松等報(bào)道一致［10］，原因可能是人工飼養(yǎng)大熊貓?zhí)砑语曃箍股匾痼w內(nèi)菌群發(fā)生了變異，導(dǎo)致雙歧桿菌大熊貓分離株在耐藥性上與其他雙歧桿菌表現(xiàn)不一致。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)雙歧桿菌大熊貓分離株對(duì)頭孢唑啉、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素及丁氨卡那霉素等高敏，因此臨床應(yīng)用雙歧桿菌制劑時(shí)應(yīng)避免與這些敏感的抗菌藥配伍，以防止抗菌藥物影響雙歧桿菌制劑的活性和功效，如果雙歧桿菌制劑需要與抗菌藥物配伍使用時(shí)，可先使用抗菌藥物控制感染后，再選用雙歧桿菌制劑來調(diào)節(jié)菌群失調(diào)，以便更好發(fā)揮其療效［11-12］。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為雙歧桿菌作為腸道正常菌，具有抑制腸道病原微生物、提高免疫力、抗腫瘤等作用［4-7］，但近期國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腸道正常菌群產(chǎn)生耐藥性后，可將其耐藥性通過一定的方式傳遞給病原菌，從而加劇病原菌的耐藥性，給腸道及非腸道感染性疾病的臨床用藥帶來很大困擾［13-14］，因此要研制大熊貓雙歧桿菌制劑，還需要從雙歧桿菌大熊貓分離株耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理以及耐藥性是否傳遞等方面作進(jìn)一步的研究，以確保其應(yīng)用的安全性。

雙歧桿菌是動(dòng)物腸道內(nèi)的原籍菌，其最適生長(zhǎng)溫度與動(dòng)物正常體溫接近為37℃，但這個(gè)溫度也是致病菌生長(zhǎng)繁殖最適宜的溫度［8］。本試驗(yàn)經(jīng)過耐溫馴化后，雙歧桿菌大熊貓分離株可在較高溫度42℃下迅速地增殖，代謝能力大為提高，且與其他乳酸菌協(xié)同發(fā)酵，有力地抑制致病菌的生長(zhǎng)，這說明耐溫馴化后雙歧桿菌制劑可用于體溫較高的患病大熊貓。

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Culture Characteristics and Drug Sensitivity Test of Two BifidobacteriumStrains in Panda

YANG Hui-ping1，MA Qing-yi2，GAO Rui1
（1.Yangling Vocational and Technical College，Yangling，Shaanxi，712100，China；
2.Shaanxi Research Center of Rare Wild Animal Rescue and Raise，Zhouzhi，Shaanxi，710402，China）

Abstract：Culture characteristics and drug sensitivity test of Bifidobacteriumare the base of studing Bifidobacteriummicroecologics.The two strains of Bifidobacteriumwere isolated from the fresh feces of panda.Through bacterial culture，drug sensitivity test and heat-resistant assay，the results showed that the best medium for panda bifidobacteria is improved broth，two strains of panda bifidobacteria are all sensitive to erythromycin and chloramphenicol ect，strong resistance to penicillin ect.At comparatively high temperature，panda bifidobacteria quickly multiplied and improved the metabolic capability，collaboratively fermented with other lactic acid bacteria，powerfully inhibited the growth of pathogenic bacteria.Panda bifidobacteria grew well in vitro.The isolated panda bifidobacteria are not extensive drug resistance strains.

Key words：panda；Bifidobacterium；culture characteristic；drug sensitivity test

作者簡(jiǎn)介：楊慧萍（1966-），女，副教授，碩士研究生，主要從事動(dòng)物病理、藥理和微生物等教學(xué)工作。

收稿日期：2014-12-10

中圖分類號(hào)：S852.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1007-5038（2015）06-0171-03