任玉鵬，張煥容，王小楠，索化夷，湯　承，岳　華（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

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四川部分雞場禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染情況調(diào)查

任玉鵬，張煥容＊，王小楠，索化夷，湯承，岳華
（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

摘 要：對四川部分雞場禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）感染情況進(jìn)行調(diào)查，為雞群REV凈化和防控提供依據(jù)。采用文獻(xiàn)報(bào)道的PCR方法，分別對來自四川新津、溫江、眉山、大邑、崇州和德陽等地6個(gè)肉種雞群共160只外表健康雞或生長發(fā)育不良、具有腺胃炎癥狀的雞只樣本進(jìn)行PCR檢測，同時(shí)將擴(kuò)增片段克隆測序以確定其正確性。結(jié)果表明，6個(gè)雞群REV群體陽性率均為100%（6/6），其中外表健康雞REV檢出率為65.8%（79/120），患腺胃炎病雞REV檢出率為82.5%（33/40）；同一只雞不同組織器官樣本的檢測結(jié)果顯示，REV在骨髓和法氏囊中的檢出率最高，分別為30%（36/120）和28.3%（34/120），提示骨髓和法氏囊是REV檢測的主要靶器官；患腺胃炎雞的腺胃中REV檢出率達(dá)25%（10/40），而外表健康雞腺胃樣本REV陽性率僅0.8%（1/120），表明REV是導(dǎo)致雞腺胃炎的重要病原之一。

關(guān)鍵詞：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；靶器官；腺胃炎；PCR檢測

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis，RE）是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）引起的一種以禽類急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、矮小綜合征、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的一類病理性綜合征?；疾‰u常表現(xiàn)為生長發(fā)育不良，胸腺和法氏囊萎縮，多器官腫瘤病變等特征［1］。REV屬于C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員，自1958年報(bào)道從火雞脾臟中分離到首株REV以來，本病就在亞歐各地廣泛流行。近年來如匈牙利［2］、印度［3］、韓國［4］等都有該病發(fā)生的報(bào)道。在我國雞群中REV感染狀況也普遍存在［5］，Sun S H等［6］從來自廣東的三黃雞受精卵中分離到一株REV；趙麗青等［7］對山東膠東地區(qū)REV血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明其檢出率高達(dá)85.71%～100%。從各地流行病學(xué)調(diào)查情況看，單純REV感染禽多不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，主要以病雞的漸進(jìn)性消瘦和因免疫抑制而繼發(fā)感染其他病原引起的病死率上升為特征，特別是在與馬立克病病毒（MDV）和禽白血病病毒（ALV）等免疫抑制性或腫瘤性病毒混合感染時(shí)，可使病情嚴(yán)重程度明顯加劇。研究表明，MDV與REV均可導(dǎo)致腫瘤病變，但在不同臟器中的含量和分布卻不相同，且共感染可延長病毒血癥時(shí)間，混合感染可顯著增加患病雞病死率［8］。對REV與J亞群ALV（ALV-J）共感染動物模型抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，REV可顯著減弱雞體對ALV-J感染誘導(dǎo)的特異性抗體反應(yīng)［9］。因此，了解本地區(qū)雞群REV的流行情況，對雞群有效凈化REV，提高雞群免疫水平和防控腫瘤性禽病具有重要意義。

本研究采用文獻(xiàn)報(bào)道的REV PCR方法檢測來自四川新津、溫江、眉山、大邑、崇州和德陽等地6個(gè)肉種雞群的3個(gè)品種1日齡120只外表健康雞和40只35日齡～40日齡具有典型的生長發(fā)育不良和腺胃炎癥狀病雞的肝臟、脾臟、腎臟、腺胃、胸腺、法氏囊和骨髓等不同組織樣本，分析樣本中REV陽性率，以期豐富該地區(qū)REV流行病學(xué)資料，為本地區(qū)雞場種源凈化和家禽疫病防控提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株及雞胚 REV-T株（毒株編號：AV107）購自中國獸藥監(jiān)察所；SPF雞胚購自成都天邦生物制品有限公司。

1.1.2主要試劑 Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD19-T Simple Vector、PrimescriptTMRT reagent Kit為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、EZNA Plasmid Mini Kit質(zhì)粒提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物的合成 按參考文獻(xiàn)［10］合成REV特異性擴(kuò)增引物：P1：5′-ATCCAATCACGAGCAAACACG-3′；P2：5′-GCCAGCCTACACCACGAACAAAAT-3′。擴(kuò)增目的片段長度為270 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。

1.2.2陽性樣本的制備 以REV-T株病毒做陽性樣本，按試劑盒說明書，用Trizol法抽提病毒RNA。用PrimescriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；反應(yīng)體系為：5×buffer 4μL；Prime Script RT Enzyme MixⅠ1μL；Random 6 mer（100）mol/L）2μL；模板4μL；加入RNase Free dH2O至20μL。反應(yīng)條件：37℃15min，85℃15s，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以制備的REV cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：P1/P2引物各1μL（10μmol/L），dNTP（2.5mmol/L）2μL，10×PCR buffer 3.5 μL，r Taq DNA聚合酶0.15μL，cDNA模板2μL，加入ddH2O至25μL。反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；置-20℃保存?zhèn)溆谩ＨCR擴(kuò)增產(chǎn)物3μL，在含溴乙錠（EB）的瓊脂糖凝膠板上點(diǎn)樣，加入DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作對照，以130V電壓電泳40min，在凝膠成像儀中觀察并拍照。

1.2.3樣品的采集與處理 從四川省新津、溫江、眉山、大邑、崇州和德陽等地的6個(gè)肉種雞養(yǎng)殖場，無菌采集3個(gè)品種120只1日齡外表健康雞和40 只35日齡～40日齡腺胃炎（腺胃腫脹、腺胃乳頭出血或消失）、生長發(fā)育不良病雞的肝臟、脾臟、腎臟、腺胃、胸腺、法氏囊和骨髓樣品各約1g，碾碎后置于1.5mL離心管，按1∶5（m∶v）加入無菌PBS充分混勻。用酚-氯仿法抽提樣品總DNA，具體方法見參考文獻(xiàn)［11］。將制備的核酸樣本置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4PCR檢測及分析 以制備的待檢雞只不同組織器官的核酸樣本為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.2.2陽性樣本制備”。取上述擴(kuò)增產(chǎn)物和制備的陽性對照樣本各3μL，在含溴乙錠的瓊脂糖凝膠板上點(diǎn)樣，加入DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作對照，以130V恒壓電泳40min，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。參照《分子克隆》（第3版）［12］將基因片段克隆至pMD19-T載體，命名為pMDREV，并送樣到上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，用Blast比對分析結(jié)果。統(tǒng)計(jì)受檢雞群REV群體陽性率、個(gè)體陽性率和不同組織器官的REV檢出率。

2　結(jié)果

2.1陽性樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將提取的REV-T株RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作陽性模板，ddH2O作陰性模板，用P1/P2特異性引物分別對陽性模板及臨床樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳后，獲得約為270bp大小的條帶，與預(yù)期目的基因長度一致（圖1）。

2.2臨床樣本擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測序結(jié)果

隨機(jī)構(gòu)建的臨床樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物重組質(zhì)粒pMD-REV經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，并用Blast比對分析結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與REV LTR基因核苷酸序列同源性均大于94.7%。測序結(jié)果如下：CCATGGTTGTAAGGGCAGATGCTATCCTCCAATGAGGGAAAATGTCATGCAACATC CTGTAAGCGGCTATATAAGCCAGGTGCATC TCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACACATTGT TGTGACGTGCGGCCCAGATTCGAATCTGTA ATAAAAGCTTTTTCTTCTATATCCTCAGAT TGGCAGTGAGAGGAGATTTTGTTCGTGGGG TATAAGAGGGGGAAA。

圖1　REV LTR基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified results of LTR REV gene segment by RT-PCR

2.3臨床樣本的檢測結(jié)果

2.3.1外表健康肉雞REV檢測結(jié)果 經(jīng)PCR檢測，6個(gè)肉種雞群120只1日齡外表健康肉雞REV陽性檢出率為65.8%（79/120），群體陽性率為100%（6/6），提示所檢地區(qū)肉種雞群REV廣泛流行，且隱性感染率較高（表1）。其中青腳麻雞、三黃雞和艾維茵雞REV陽性率分別為66.7%、62.5% 和70.0%，差異不顯著（P＞0.05），表明REV對3個(gè)品種肉雞均有較高易感性。

2.3.2腺胃炎病雞REV檢測結(jié)果 對來自新津、大邑、崇州和溫江的4個(gè)雞群40只35日齡～40日齡臨床表現(xiàn)為腺胃炎（腺胃腫脹、腺胃乳頭出血或消失）、生長停滯，漸進(jìn)性消瘦，胸腺、法氏囊萎縮的肉雞不同組織器官PCR檢測結(jié)果表明REV檢出率為82.5%（表2）。

2.3.3不同組織器官REV檢測結(jié)果 外表健康雞骨髓和法氏囊樣品陽性檢出率最高，分別為30.0%和28.3%；肝臟檢出率為1.7%，腺胃的檢出率最低，僅為0.8%（表3）。腺胃炎病雞在法氏囊中檢出率為30%，在骨髓和腺胃的檢出率為25%，肝臟的檢出率僅2.5%。結(jié)果表明，不論亞臨床癥狀或發(fā)病雞只，在骨髓和法氏囊中REV陽性檢出率均最高；而臨床腺胃炎病雞腺胃中REV陽性檢出率顯著高于外表健康雞，提示對患病雞REV檢測時(shí)，腺胃也是具有重要診斷意義的靶器官之一。

表1　外表健康肉雞REV陽性檢出率Table 1 REV positive rate of detected broiler flocks

表2　腺胃炎肉雞的REV檢測結(jié)果Table 2 The detection result of REV in proventriculitis broilers

表3　不同組織器官的REV陽性檢出率Table 3 The positive rate of REV in different tissues

3　討論

RE的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查常用方法主要包括分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)診斷法。由于REV毒株血清型單一，不存在主要亞型間差異，故瓊擴(kuò)試驗(yàn)、免疫組化、間接免疫熒光（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等免疫學(xué)檢測方法具有良好的特異性。Li K等［13］用重組畢赤酵母表達(dá)的REV gp90蛋白作包被抗原建立了一種間接ELISA方法，與病毒中和試驗(yàn)及商品化試劑盒檢測結(jié)果符合率均高于96.3%；張文娟等［14］用pGEX-4T-3載體原核表達(dá)env基因片段，將重組蛋白做抗原建立的間接ELISA法與已有的IFA法和IDEXX公司IREV-ELISA試劑盒進(jìn)行比較，結(jié)果符合率均高于90%，表明該方法適用于大規(guī)模REV抗體的監(jiān)測。此外隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR、熒光定量PCR［15］及環(huán)介導(dǎo)等溫PCR［16］等技術(shù)以其快速、靈敏、特異的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多種禽病病原的實(shí)驗(yàn)室檢測；目前關(guān)于REV的分子生物學(xué)檢測法主要針對其LTR、pol和env基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物；吳萍萍等［17］分別用REV LTR基因和雞傳染性貧血病毒（CIAV）全基因序列為模板設(shè)計(jì)引物建立了一種敏感特異的雙重PCR檢測法；Deng X等［18］則應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫PCR擴(kuò)增技術(shù)，以pol基因?yàn)榘谢虺醪浇⒘艘环N新型的REV檢測法，可用于不同REV株的鑒別；因此本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)合成的一對基于LTR基因的特異性引物，用于分子流行病學(xué)調(diào)查，檢測結(jié)果具可靠性。

本研究對采自四川部分肉雞場不同品種外表健康肉雞多種組織器官的PCR檢測結(jié)果表明，各器官REV陽性檢出率差異顯著。其中骨髓和法氏囊樣本陽性檢出率最高，這與劉紹瓊等［19］用免疫組化法和間接免疫熒光法對REV抗原定位的研究結(jié)果相符，提示病毒對這兩種器官具一定的偏嗜性，骨髓和法氏囊是REV檢測的重要靶器官。另外，在本研究中，臨床表現(xiàn)為腺胃炎癥狀的35日齡～40日齡肉雞腺胃樣本REV陽性率顯著高于1日齡外表健康肉雞腺胃樣本，分析REV的存在與腺胃炎癥狀的出現(xiàn)密切相關(guān)，至于究竟是REV感染導(dǎo)致腺胃炎，還是其他因素引起腺胃炎后使得機(jī)體對REV的易感性增強(qiáng)，有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外本實(shí)驗(yàn)室還對樣本的ALV感染情況同時(shí)進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ALV和REV共感染率達(dá)46.7%，故臨床腺胃炎病雞腺胃組織中這兩種病原檢出率的顯著升高可能是由于這兩種病原的混合或繼發(fā)感染所致。據(jù)現(xiàn)有研究資料報(bào)道，由于REV在基因組復(fù)制過程中，其前病毒DNA除能整合到宿主細(xì)胞基因組外，還可通過整合到共感染病原的基因組上增強(qiáng)共感染病原對宿主細(xì)胞的感染能力；繼發(fā)感染對宿主機(jī)體防御屏障的破壞也可間接增強(qiáng)REV的感染力。

本試驗(yàn)對取自四川省6個(gè)縣市6群外表健康1日齡肉種雞和4群臨床表現(xiàn)為腺胃炎的病雞樣品PCR檢測結(jié)果表明，受檢雞群REV陽性率為100%（6/6），其中外表健康雞群REV陽性率高達(dá)65.8%（79/120），臨床表現(xiàn)為腺胃炎的雞群REV陽性率高達(dá)82.5%（33/40），提示該病毒在本地區(qū)雞群中廣泛存在。因此對REV的有效防控，除凈化雞群REV外，防止繼發(fā)感染或混合感染ALV、MDV等病原也是重點(diǎn)。

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Survey of Reticuloendotheliosis Virus Infection in Chicken Farms of Sichuan Province

REN Yu-peng，ZHANG Huan-rong，WANG Xiao-nan，SUO Hua-yi，TANG Cheng，YUE Hua
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Abstract：In order to investigate reticuloendotheliosis virus（REV）infection in Sichuan province to provide theoretical basis for the prevention of REV，apairs of specific primers were synthesized according to the reference，and a total of 120one-day-old apparently healthy chickens and 40proventriculitis suffered chicks of 35to 40day-old age from 6poultry farms were tested by PCR.The amplified fragments were cloned into pMD19-T vector and were sequenced for identification.The results showed that the detected positive rate of REV in six groups were 100%（6/6），the detected positive rate in 120apparently healthy chickens was 65.8%（79/120）and in that of 40proventriculitis suffered chicks was 82.5%（33/40）.It suggested that REV widely spread in Xinjin，Wenjiang，Meishan，Dayi，Chongzhou and Deyang of Sichuan province. The detected positive rates in different collected chicken tissue samples were also significantly different among various tissue samples，with the higher positive rates in both bursa of Fabricius（28.3%）and marrow（30%）in apparently healthy chickens，which implied that these two organs were the better detection target organs of REV.In addition，the REV detection rate in chicks suffered proventriculitis was significantly higher than that of apparently healthy chickens.It showed that REV may be related to proventriculitis.

Key words：REV；target organ；proventriculitis；PCR detection

作者簡介：任玉鵬（1986-），男，四川雅安人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：“十二五”國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA101304）

收稿日期：2014-11-20

中圖分類號：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1007-5038（2015）06-0162-05