李海濤，苗利光，朱言柱，肖佳美，劉艷環(huán)（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130112）

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牛傳染性鼻氣管炎病毒JZ06-8株犢牛感染模型的建立

李海濤，苗利光，朱言柱，肖佳美，劉艷環(huán)＊
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130112）

摘 要：為建立IBRV對犢牛的感染模型，將試驗組第1組～3組犢牛通過鼻腔內(nèi)噴霧接種4mL/頭，病毒含量分別為107.0TCID50/mL、106.0TCID50/mL和105.0TCID50/mL的IBRV/JZ06-8，陰性對照組同樣方法接種MDBK細(xì)胞凍融物；攻毒后第0天～第14天，每天測定直腸溫度，進(jìn)行臨床觀察，采集鼻拭子進(jìn)行病毒分離鑒定。結(jié)果顯示，鼻內(nèi)噴霧接種對犢?？僧a(chǎn)生有效感染，106.0TCID50/mL的感染劑量即可致犢牛產(chǎn)生典型的IBR臨床癥狀，并可分離到IBRV。試驗成功實現(xiàn)IBRV/JZ06-8對犢牛的感染，該模型可用于IBRV研究和IBR疫苗評價。

關(guān)鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎病毒；感染模型；實時熒光定量PCR

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起牛的一種接觸性傳染病，又稱壞死性鼻炎（Necrotic rhinitis）、紅鼻?。≧ed nose disease）。臨床表現(xiàn)為上呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻汁等癥狀，還可引起生殖道感染、結(jié)膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)、乳房炎等多種臨床疾?。?］。本病自1955年美國首次報道以來，世界各地都相繼發(fā)生和流行［2］。我國于20世紀(jì)80年代以來，先后從奶牛、水牛、黃牛、牦牛等病牛體內(nèi)分離出了IBRV。該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物疫病，也被我國列為二類動物傳染病。本病主要感染牛，尤以肉用牛多見，其次是奶牛，肉用牛群的發(fā)病率高達(dá)75%［3-5］。研制安全有效的IBR疫苗是控制該疾病的主要方法之一。本研究用不同滴度的IBRV對犢牛進(jìn)行感染，通過臨床癥狀、生理指標(biāo)變化及病毒分離鑒定等指標(biāo)評價，最終成功建立了IBRV動物感染模型。為IBRV研究和IBR疫苗效力評價提供了有效的技術(shù)支持。

1　材料方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和毒種 牛傳染性比支氣管炎IBRV/ JZ06-8株病毒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動物疫病研究室分離保存；MDBK細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2試驗用動物和試劑 4月～6月齡健康犢牛，IBRV中和試驗檢測為陰性。MEM、馬血清購自Gibico公司；病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）購自Toyobo公司。

1.2方法

1.2.1病毒制備 將超低溫保存的IBRV/JZ06-8株病毒，按2.5%接種量接種到培養(yǎng)至單層的MDBK細(xì)胞，37℃孵育5 min～10 min，加入含20 mL/L馬血清的MEM培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d～4d，連續(xù)培養(yǎng)4代。

用含20mL/L馬血清的MEM培養(yǎng)液將病毒稀釋10-5～10-10倍后接種于培養(yǎng)至單層的MDBK細(xì)胞96孔板，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d～4d后觀察結(jié)果，測定病毒毒價。至病毒含量大于107.0TCID50/mL后，即可做為感染毒用于感染試驗。

1.2.2感染方法 將20頭犢牛隨機(jī)分成4組，每組5頭。第1組至第3組為試驗組，鼻內(nèi)噴霧接種IBRV/JZ06-8，4mL/頭，2mL/鼻孔，病毒含量分別為107.0TCID50/mL、106.0TCID50/mL和105.0TCID50/mL；第4組為陰性對照組，按同樣方法接種MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物。在牛吸氣時噴入病毒液，并使牛頭處于向上狀態(tài)2min～5min［6］。攻毒后樣品立即低溫保存運(yùn)回實驗室回滴測定病毒毒價。

1.2.3臨床檢查 攻毒后第0天～第14天，每天測定直腸溫度，進(jìn)行臨床觀察，包括呼吸狀況、精神狀態(tài)、黏膜病變和鼻液等，并根據(jù)發(fā)病程度進(jìn)行評分（無臨床癥狀者為0分，癥狀嚴(yán)重者為滿分5分）。

1.2.4病毒分離鑒定 攻毒后每天采集鼻拭子，置于含20mL/L馬血清的MEM培養(yǎng)基中低溫保存。將鼻拭子液加入培養(yǎng)至單層的MDBK細(xì)胞96孔板中，每個樣品做復(fù)孔，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d～4d。觀察細(xì)胞病變，出現(xiàn)細(xì)胞病變的判定為病毒分離陽性。依照病毒DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒DNA模版提取。根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］設(shè)計擴(kuò)增片段上游引物P1：5′-GGACATGGCGGAGACGGTGGT-3′，下游引物P2：5′-CAACAAGGGCGGGGAAGCAG-3′。建立25μL實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板1μL，滅菌去離子水9.5μL；反應(yīng)條件：95℃30s；95℃20s，56℃30s，72℃60s，50個循環(huán)；在72℃反應(yīng)時采集熒光信號；然后采用55℃～95℃以0.5℃為1個單位采集熒光信號，制備溶解曲線。Ct＜35，曲線呈S型，認(rèn)為待檢IBRV樣本DNA檢測呈陽性（Ct越小，初始病毒量越多）［9-10］。

1.2.5分析方法 病毒含量用Reed-Muench法計算，結(jié)果用TCID50/mL表示。

2　結(jié)果

2.1病毒毒價測定結(jié)果

用于攻毒模型試驗的攻擊毒，病毒含量為107.39TCID50/mL。攻毒后，實驗室回滴結(jié)果顯示第1組至第3組病毒含量分別為106.69TCID50/mL、105.44TCID50/mL和104.39TCID50/mL。

2.2體溫變化和臨床觀察結(jié)果

第1組犢牛在攻毒后第2天開始出現(xiàn)體溫升高、發(fā)熱的現(xiàn)象，第3天體溫最高值為40.8℃，之后體溫逐漸下降，第10天下降至正常水平；同時臨床觀察顯示，攻毒后第3天開始出現(xiàn)鼻黏膜充血、腫脹，之后出現(xiàn)眼部出現(xiàn)水樣分泌物，精神萎靡，食欲不振，第12天痊愈（圖1）。第2組在攻毒后第2天～第6天出現(xiàn)體溫升高現(xiàn)象，最高值為40.4℃，第7天恢復(fù)正常；臨床癥狀明顯，鼻腔有大量鼻液、鼻黏膜充血、腫脹，眼部出現(xiàn)水樣分泌物，精神萎靡等臨床癥狀（圖2）。第3組體溫基本沒有太大變化，臨床癥狀只出現(xiàn)了輕微的鼻黏膜紅腫、流鼻液，第5天后恢復(fù)正常（圖3）。陰性對照組沒有出現(xiàn)IBRV感染常見癥狀。

2.3病毒分離

攻毒后每天采集鼻拭子，然后加入培養(yǎng)至單層的MDBK細(xì)胞96孔板中，觀察細(xì)胞生長狀況。結(jié)果顯示第1組在攻毒后第2天～第10天均能分離到病毒，第2組在攻毒后第4天～第9天能分離到病毒，其他組未分離到病毒（表1）。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示第1組在攻毒后第2天～第10天樣本DNA檢測呈陽性，其中第7天和第9天的檢測結(jié)果病毒含量較高；第2組在攻毒后第3～第9天樣本DNA檢測呈陽性，其中第6天的檢測結(jié)果病毒含量較高；第3組樣本DNA檢測第5天呈陽性，但病毒含量較低；陰性對照組未檢測到病毒。細(xì)胞病變觀察結(jié)果與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果基本一致。

圖1　第1組攻毒后平均體溫變化和臨床癥狀平均分值變化Fig.1 The average body temperature and clinical score of group 1after challenge

圖2　第2組攻毒后平均體溫變化和臨床癥狀平均分值變化Fig.2 The average body temperature and clinical score of group 2after challenge

圖3　第3組攻毒后平均體溫變化和臨床癥狀平均分值變化Fig.3 The average body temperature and clinical score of group 3after challenge

表1　分離病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)觀察結(jié)果Table 1 The CPE results of isolated viruses

3　討論

牛傳染性鼻支氣管炎無特效的藥物治療，所以在發(fā)病時不同國家對該病采取的控制方法也不同，一些國家采取了加強(qiáng)護(hù)理，預(yù)防繼發(fā)感染，而有的國家對發(fā)病牛則進(jìn)行撲殺。接種疫苗是控制和預(yù)防本病的主要措施。但是目前國內(nèi)還沒有商品化的疫苗，因此，研制和開發(fā)安全有效的疫苗迫在眉睫。建立恰當(dāng)?shù)膭游锔腥灸Ｐ褪遣≡芯?，特別是疫苗研制過程中最重要的研究內(nèi)容。

IBRV可以通過多種途徑人工感染牛［1］。最常見的感染類型呼吸道感染途徑，感染后病?？沙霈F(xiàn)高熱、咳嗽、流鼻汁、鼻黏膜炎性病變、呼吸困難等呼吸道癥狀。IBRV也可以通過結(jié)膜感染牛，臨床表現(xiàn)為結(jié)膜炎癥，可見結(jié)膜充血、眼瞼水腫、流眼淚等癥狀。IBRV還可以通過生殖道感染，主要表現(xiàn)為母牛陰道炎癥和公牛龜頭炎癥。由于IBRV通過呼吸道感染途徑對牛的發(fā)病率為10%～90%，病死率為1%～5%［11］，且病牛不斷從鼻腔、氣管向外界排毒，通過空氣、飛沫和病牛直接接觸而傳播［12］，因此對牛群的健康威脅比其他感染途徑較為嚴(yán)重。選擇鼻腔人工感染途徑主要是由于IBRV呼吸道感染造成的臨床癥狀較為嚴(yán)重，并且具備特征性呼吸道黏膜炎癥病變，有利于臨床觀察，為研究鼻腔接種的IBR活疫苗提供客觀的評價體系。

研究結(jié)果顯示，鼻內(nèi)噴霧接種IBRV/JZ06-8病毒對犢?？僧a(chǎn)生有效感染，證明鼻腔內(nèi)接種這一感染途徑是可行的；106.0TCID50/mL、4mL/頭的感染劑量即可致犢牛產(chǎn)生明顯的體溫升高，體溫可達(dá)40℃以上，產(chǎn)生大量鼻液、鼻黏膜充血、腫脹，眼部出現(xiàn)水樣分泌物等典型IBRV感染臨床癥狀，并可在感染期分離到IBRV，說明該劑量可作為感染模型的有效劑量。本研究建立的IBRV犢牛人工感染的模型，可為IBRV研究和IBR疫苗效力評價提供技術(shù)支持。

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Establishment of a Calf Infection Model of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus Strain IBRV/JZ06-8

LI Hai-tao，MIAO Li-guang，ZHU Yan-zhu，XIAO Jia-mei，LIU Yan-huan
（Institute of Special Economic Animal and Plant Science，CAAS，Changchun，Jilin，130112，China）

Abstract：To study the infection model of calves with IBRV/JZ06-8，the calves of group1，2and 3were immunized in nasal spray with IBRV/JZ06-8（107.0TCID50/mL，106.0TCID50/mL and 105.0TCID50/mL）4mL/calf.The calves in negative control group was immunized in nasal spray with MDBK 4mL/calf.In 0-14dafter challenge，the body temperature and clinical scores were recorded.The nose swabs were used for virus isolation and identification.The results showed that the calves had typical infection after inoculation in nasal spray with IBRV/JZ06-8（106.0TCID50/mL，4mL/calf），and the IBRV was isolated from the nose swabs.The infection model of calves with IBRV/JZ06-8was established.

Key words：Infectious bovine rhinotracheitis virus；infection model；real-time PCR

作者簡介：李海濤（1981-），男，河北邯鄲人，助理研究員，主要從事動物病原生物學(xué)和分子免疫學(xué)研究。＊通訊作者

收稿日期：2014-10-19

中圖分類號：S852.653

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）06-0115-04