田 多， 王修俊*， 周沅潔， 王紀(jì)輝， 劉佳慧， 尹 爽

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

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磷尾礦表層土壤解磷菌的篩選及鑒定

田 多1,2， 王修俊1,2*， 周沅潔2， 王紀(jì)輝2， 劉佳慧2， 尹 爽2

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

為實(shí)現(xiàn)廢棄資源利用、提高磷利用率，采用無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基篩選、透明圈試驗(yàn)、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及16S rDNA序列測(cè)定等方法對(duì)磷尾礦表層土壤中解磷菌進(jìn)行研究。結(jié)果表明：從磷尾礦表層土壤中分離出具有解磷效果的菌株11株，命名為K1～K11，其中，K4和K7菌株的解磷能力較強(qiáng)；接種K4和K7菌株的無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液發(fā)酵2 d后其磷含量分別達(dá)335.47 μg/mL和282.31 μg/mL，Ca3(PO4)2分解率分別達(dá)16.83%和14.16%。經(jīng)鑒定，K4屬熒光假單胞菌，K7屬膠質(zhì)芽孢桿菌。

磷尾礦； 解磷菌； 廢棄資源； 磷利用率

磷礦是化學(xué)礦物的一種，2005年全球磷礦產(chǎn)量達(dá)1.85億t[1]。我國(guó)雖是磷礦生產(chǎn)和使用大國(guó)[2]，但80%磷礦為中低品位[3]，富礦稀少[4]，且由于選礦技術(shù)落后，每年產(chǎn)生的磷尾礦達(dá)700萬(wàn)t左右[5]。

磷尾礦是磷礦開(kāi)采浮選后的副產(chǎn)物，磷含量低，有害雜質(zhì)含量較高，進(jìn)一步投入工業(yè)生產(chǎn)成本高，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)預(yù)期的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，從而成為生產(chǎn)的負(fù)累。因此，大量的磷尾礦未能得到利用，甚至被無(wú)控地堆積、廢棄，造成巨大的資源浪費(fèi)，環(huán)境也受到嚴(yán)重破壞[6-7]。如何處理廢棄的磷尾礦，成為各大礦業(yè)公司的技術(shù)與環(huán)境難題。

N、P和K等元素的缺乏是限制作物增產(chǎn)的主要因素，我國(guó)農(nóng)田土壤普遍缺磷，而磷在土壤中大多以難溶的形態(tài)存在，植物對(duì)土壤磷元素的利用率很低，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)特別是農(nóng)作物的產(chǎn)量[8]，施肥是影響土壤質(zhì)量及其可持續(xù)利用的農(nóng)業(yè)措施之一[9]，但施肥不科學(xué)易導(dǎo)致產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)[10]。目前，有關(guān)如何提高植物對(duì)磷利用率的研究國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道。李蓉[11]從杉木根際篩選出有機(jī)、無(wú)機(jī)解磷菌各12株。李劍峰[12]篩選苜蓿根瘤菌和紅豆草根瘤菌LW107、RSW96，在固氮的同時(shí)能夠轉(zhuǎn)化一部分有效磷。王義[13]通過(guò)試驗(yàn)篩選得到37株解磷菌，其中，5株為高效解磷菌，并通過(guò)大豆大棚試驗(yàn)驗(yàn)證。俞新玲[14]篩選得到解磷菌7株，分別為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和梭形桿菌屬，其對(duì)磷酸一氫鈣的解磷活力較強(qiáng)。葉震[15]篩選得到解磷菌13株，分別為歐文氏菌、假單胞菌和蒲城沙雷菌。賀夢(mèng)醒[16]從尾礦廢棄處根際土樣篩選得到2株解磷菌，分別為芽孢桿菌和出芽短梗霉菌。貴州各大礦業(yè)公司普遍存在磷尾礦大量堆積無(wú)法利用的現(xiàn)象，為此，筆者于2012年對(duì)貴州磷尾礦表層土壤的微生物進(jìn)行研究，以期能篩選出具有高效解磷能力的微生物，為實(shí)現(xiàn)微生物降解磷尾礦渣和廢棄資源利用做出貢獻(xiàn)，并為生產(chǎn)含磷有機(jī)肥料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤 參考黃新榮等[17]的方法從貴州甕福(集團(tuán))有限責(zé)任公司磷尾礦渣堆積處采集表層土壤。

1.1.2 儀器與設(shè)備 漩渦混合器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；移液槍?zhuān)簖堘t(yī)療設(shè)備(上海)有限公司；垂直凈化工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；手提式滅菌鍋，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；722S分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 試劑 硫酸銨、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、磷酸鈣、酒石酸氧銻鉀、鉬酸銨、左旋抗壞血酸、濃硫酸等，均為分析純。

0.5 mol/L NaHCO3浸提液：溶解NaHCO342.0 g于800 mL水中，以0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)浸提液的pH至8.5。

磷標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4(分析純)0.219 5 g，溶解在400 mL水中，加入濃H2SO45 mL(加H2SO4防長(zhǎng)霉菌，可使溶液長(zhǎng)期保存)，轉(zhuǎn)入1 L容量瓶中，加水至刻度。此溶液為50 μg/mL P標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.4 培養(yǎng)基

1) 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

2) 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，121℃滅菌30 min。

3) 無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基。葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3(PO4)210 g、蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。

4) 無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，121℃滅菌30 min。

1.1.5 其他 無(wú)磷活性炭?；钚蕴砍：辛?，需做空白試驗(yàn)檢驗(yàn)有無(wú)磷存在。

1.2 菌種的分離

1.2.1 富集培養(yǎng) 將采集的土樣加入適當(dāng)無(wú)菌水潤(rùn)濕，放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置，富集培養(yǎng)若干天。然后取5 g土樣置于250 mL三角瓶中，加入玻璃珠和無(wú)菌水50 mL，在搖床上，以120 r/min的轉(zhuǎn)速持續(xù)20 min。取0.2 mL菌懸液裝于有50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)4 d。

1.2.2 純化培養(yǎng) 將富集后的菌液稀釋5個(gè)梯度，分別為10-1～10-5，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d。待平板上的菌落可分辨時(shí)，在無(wú)菌條件下，將菌落接種至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，劃線分離，30℃下恒溫靜置培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接，直至得到單菌落。

1.3 菌種解磷能力測(cè)定

1.3.1 溶磷圈測(cè)量 在無(wú)菌條件下，將純化后的單菌用無(wú)菌水稀釋?zhuān)缓簏c(diǎn)接于無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，3個(gè)平行，30℃下恒溫靜置培養(yǎng)1～3 d后觀察。有透明溶磷圈者即為解磷菌株，將得到的解磷菌株命名為Ki(i=1,2,3…n)。測(cè)量菌落直徑(φ)和透明圈直徑(Φ)，計(jì)算透明圈與菌落直徑比(Φ/φ)。將解磷菌株純化后接種于試管斜面上，4℃冰箱保藏備用。選擇透明圈直徑與菌落直徑比(Φ/φ)較大的菌株進(jìn)行解磷能力定量測(cè)定。

1.3.2 種子液的制備 1) 活化。配置牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分裝于250 mL窄口三角瓶中，每瓶100 mL，每菌2個(gè)平行。滅菌、冷卻、備用。在無(wú)菌條件下將解磷菌K4、K7、K9，從斜面上接種到三角瓶中，30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。2) 發(fā)酵。配置無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基，分裝于250 mL廣口三角瓶中，每瓶100 mL，每菌2個(gè)平行。滅菌、冷卻、備用。將活化后的液體菌液，按照5%的接種量，接種于廣口瓶中，30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 d。對(duì)照接入與解磷菌等體積的無(wú)菌水。

1.3.3 測(cè)定方法 1) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別準(zhǔn)確吸取5 μg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL放入150 mL三角瓶后，加入0.5 mol/LNaHCO3溶液10 mL，并加水使各瓶的總體積達(dá)45 mL，搖勻；然后加入鉬銻抗試劑5 mL混勻顯色；繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后溶液中磷的濃度分別為0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL和0.5 μg/mL。2) 樣品測(cè)定。將待測(cè)解磷菌活化后接種至無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d后，按照上述方法，對(duì)無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液進(jìn)行前處理，用分光光度計(jì)測(cè)定其光吸收值。將試驗(yàn)得出的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的磷濃度，再根據(jù)公式計(jì)算出發(fā)酵液中的有效磷含量(mg/kg)。計(jì)算公式如下：

式中：ρ，從工作曲線上查得P的質(zhì)量濃度(μg/mL)；V，顯色時(shí)定容體積(mL)；ts，為分取倍數(shù)(即浸提液總體積與顯色對(duì)吸取浸提液體積之比)；m，風(fēng)干土質(zhì)量(g)；k，將風(fēng)干土換算成烘干土質(zhì)量的系數(shù)。

1.4 菌種的鑒定

1.4.1 菌種的形態(tài)特征 1) 菌落形態(tài)特征觀察。將解磷菌株接種于平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)，并記錄。2) 菌株個(gè)體形態(tài)特征觀察。對(duì)解磷菌株個(gè)體形態(tài)進(jìn)行觀察，分別進(jìn)行鏡檢、革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和運(yùn)動(dòng)性觀察等試驗(yàn)，并記錄。

1.4.2 菌種測(cè)序

1) 提取基因。按照生工SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取。對(duì)菌株進(jìn)行基因DNA的提取純化，16S rDNA序列分析參考汪華等[19]的鑒定方法進(jìn)行。

上引物序列：P1(5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’)

下引物序列：P2(5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)

2) PCR反應(yīng)體系(25 μL)。模板DNA 1 μL，10 μmol/L前引物0.5 μL，10 μmol/L后引物0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，加水至25 μL。

3) PCR反應(yīng)條件。94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性35 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，以瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，純化回收產(chǎn)物并鑒定。

1.5 菌種的生理生化特性測(cè)定

1.5.1 耐溫性 將解磷菌株接種于平板上，分別在4℃、10℃、20℃、30℃、37℃、41℃、45℃和65℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況并記錄。

1.5.2 pH耐受性 配置固體培養(yǎng)基，并用HCl、NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH分別為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5和11，滅菌倒平板、冷卻后接種，30℃下培養(yǎng)3～5 d后觀察菌株生長(zhǎng)情況并記錄。

1.5.3 耐鹽性 配置固體培養(yǎng)基，并用NaCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽濃度，使其分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%。滅菌倒平板、冷卻后接種，30℃下培養(yǎng)3～5 d后觀察菌株生長(zhǎng)情況并記錄[18]。

1.5.4 其他生理生化特性 參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》考察解磷菌株的熒光色素、接觸酶、淀粉水解、明膠液化、V-P測(cè)定、吲哚、甲基紅、硝酸鹽還原、過(guò)氧化氫酶等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的菌株分離

將純化后的菌種接種于無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，其中，有11株菌株能夠產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明其具有一定的解磷能力，確定為解磷菌株，按1.3.1中所述命名為K1～K11。從表1可知，解磷菌K2、K5、K7、K9和K10的透明圈直徑均≥10 mm，解磷菌K1、K4、K8和K11的透明圈直徑均≥8 mm，解磷菌K4、K7和K9的透明圈直徑與菌落直徑比(Φ/φ)均超過(guò)2，說(shuō)明，解磷菌K4、K7和K9具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)的解磷能力。

表1 解磷菌不同菌株的透明圈與菌落直徑

圖1 有效磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.1 The standard curve of available phosphorus in soil

2.2 解磷菌株的解磷能力

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 從圖1可見(jiàn)，各測(cè)試點(diǎn)分布均勻，均在直線y=4.703 2x+0.033(R2=0.999 4>0.99)附近。說(shuō)明，其線性關(guān)系很好，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度恰當(dāng)，加樣誤差較小，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小。

2.2.2 解磷菌株的解磷效果 對(duì)接種解磷菌K4、K7、K9菌株2 d后的無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液進(jìn)行磷含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)：K4和K7菌株對(duì)發(fā)酵液中Ca3(PO4)2的分解率分別為16.83%和14.16%，發(fā)酵液有效磷含量分別為335.47 μg/mL和282.31 μg/mL，均超過(guò)200 μg/mL，與空白(18.72 μg/mL)相比，差異顯著；K9菌株對(duì)發(fā)酵液中Ca3(PO4)2的分解率為2.52%，發(fā)酵液中有效磷含量只有50.32 μg/mL，與空白之間的差異不顯著。說(shuō)明，K4、K7菌株具有明顯的解磷能力，K9菌株解磷效果不明顯。后續(xù)試驗(yàn)對(duì)K4、K7菌株進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 K4菌株為桿菌，革蘭氏染色呈陰性、無(wú)芽孢、有單極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，菌落顏色為淡黃色，菌落形態(tài)呈光滑的圓形；K7菌株為桿菌，革蘭氏染色呈陰性，有橢圓形芽孢，有周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)、菌落顏色無(wú)色透明，菌落形態(tài)呈光滑的圓形。

2.3.2 菌種的耐受性 K4菌株的耐受溫度為4～41℃，耐受pH為6～8.5，耐鹽濃度為6%；K7菌株的耐受溫度為10～45℃，耐受pH為6～9，耐鹽濃度為3%。

2.3.3 生理生化指標(biāo) 從表2可知，16組生理生化試驗(yàn)中，呈現(xiàn)陽(yáng)性、陰性和未反應(yīng)的組數(shù)K4菌株分別為10組、3組、3組，K7菌株為5組、8組、3組。

表2 解磷菌K4和K7的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Physiological and biochemical results of K4and K7Strains of phosphate dissolving bacteria

項(xiàng)目Items菌株StrainsK4K7熒光色素Fluorochrome+-接觸酶Catalase++氧化酶Oxidase+-水解淀粉Hydrolyzedstarch-+明膠液化Gelatinliquefaction++V-P試驗(yàn)V-Ptest--吲哚試驗(yàn)Indoletest+-甲基紅Methylred--還原硝酸鹽Reducingnitrate++過(guò)氧化氫酶Catalase++檸檬酸鹽Citrate+精氨酸雙水解酶Argininedihydrolase+卵黃反應(yīng)Eggyolkreaction+苯丙氨酸脫氫酶Phenylalaninedehydrogenase-脲酶Urease-酪素水解Caseinhydrolysis-

注：空白表示未發(fā)生反應(yīng)。

Note: Black means that the reaction is not occurred.

注：左圖為K4和K7菌株的PCR產(chǎn)物電泳圖譜，右圖為DNA Marker。

Note：Left, Electrophoretogram of PCR products of K4and K7strains; Right, DNA marker.

圖2 解磷菌K4和K7的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.2 Electrophoretogram of PCR products of K4and K7strains

注：左為K4菌株，右為K7菌株。

Note: Left, K4strain; Right, K7strain.

圖3 解磷菌K4和K7的16S rDNA序列

Fig.3 16S rDNA sequence of K4and K7strains

2.3.4 16S rDNA序列測(cè)定 從圖2可知，在1 200～1 500 bp出現(xiàn)2條明顯的亮帶，說(shuō)明，PCR擴(kuò)增成功，滿足DNA序列測(cè)定要求；且K4和K7菌株的分子量接近，均處于1 200～1 500 bp。從圖3可知，K4菌株屬細(xì)菌域—變形菌門(mén)—γ-變形菌綱—假單胞菌目—假單胞菌科—假單胞菌屬—熒光假單胞菌。K7菌株屬細(xì)菌域—厚壁菌綱—芽孢桿菌目—芽孢桿菌科—類(lèi)芽孢桿菌屬—膠質(zhì)芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

1) 研究結(jié)果表明，從磷尾礦表層土壤分離篩選出解磷菌11株。其中，K4、K7和K9菌株的透明圈直徑與菌落直徑比(Φ/φ)均超過(guò)2，說(shuō)明，有一定的解磷效果。

2) K4和K7菌株的解磷能力相對(duì)較強(qiáng)。接種K4的無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液發(fā)酵2 d后磷含量達(dá)335.47 μg/mL，Ca3(PO4)2分解率達(dá)16.83%；K7略低于K4，發(fā)酵液中磷含量達(dá)282.31 μg/mL，Ca3(PO4)2分解率達(dá)14.16%。

3) 通過(guò)形態(tài)觀察、耐受性試驗(yàn)、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA測(cè)序，最終確定K4屬熒光假單胞菌，K7屬于膠質(zhì)芽孢桿菌。

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(責(zé)任編輯： 王 海)

Screening and Identification of Phosphate Dissolving Bacteria in Surface Soil of Phosphate Tailings

TIAN Duo1,2， WANG Xiujun1,2*， ZHOU Yuanjie2， WANG Jihui2， LIU Jiahui2， YIN Shuang2

(1.SchoolofLiquorandFoodEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.GuizhouKeyLaboratoryofFermentationEngineeringandBiologicalPharmacy,Guiyang,Guizhou550025,China)

Phosphate dissolving bacteria in surface soil of phosphate tailings were studied by selection of inorganic phosphorus medium, transparent zone test, morphological observation, physiological and biochemical determination and 16S rDNA sequence analysis to screen strains with phosphate dissolving capacity, realize utilization of waste resources and improve utilization rate of phosphate.Results:11 strains (K1～K11) with phosphate dissolving capacity are isolated. K4and K7strains have the strong phosphate dissolving capacity. The phosphate content of K4and K7strains inoculated on inorganic phosphate fermentation liquor after 2 d reaches 335.47 μg/mL and 282.31 μg/mL and their Ca3(PO4)2decomposition rates are 16.83% and 14.16% respectively. K4and K7strain is identified asPseudomonasfluorescensandBacillusmucilaginosusseparately.

phosphate tailings; phosphate dissolving bacteria; waste resources; phosphate utilization rate

2015-03-08； 2015-06-19修回

貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目“基于生物技術(shù)的磷尾礦渣與秸稈綜合利用技術(shù)研發(fā)”[黔科合SY(2010)3041]；生物重大專(zhuān)項(xiàng)“調(diào)味品行業(yè)酶應(yīng)用與釀造共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)”[筑科農(nóng)合(2010)8-2]

田 多(1992-)，男，在讀碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：1058550572@qq.com

*通訊作者：王修俊(1965-)，男，教授，從事發(fā)酵工藝方面的研究。E-mail：wangxiujun678@sohu.com

1001-3601(2015)07-0397-0202-04

S154.39

A