王 蓉， 鄒時英， 付大友， 張 洪, 李艷清

(四川理工學(xué)院分析測試中心， 四川 自貢 643000)

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超聲波-微波協(xié)同提取決明子大黃酚的工藝優(yōu)化

王 蓉， 鄒時英， 付大友， 張 洪, 李艷清

(四川理工學(xué)院分析測試中心， 四川 自貢 643000)

為充分利用決明子資源,在超聲波功率內(nèi)置為50 W的儀器條件下，采用單因素試驗和正交試驗考察了提取時間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對決明子中大黃酚提取率的影響。結(jié)果表明：提取大黃酚的最佳條件為 60%乙醇作提取溶劑，微波功率60 W，提取時間40 min，料液比1∶15(g/g)。在該條件下，決明子大黃酚提取率達(dá)2.4%。

決明子； 大黃酚； 超聲波-微波協(xié)同； 提取工藝； 優(yōu)化

決明子為豆科植物決明或小決明的成熟干燥種子，具有清肝明目，潤腸通便之功效[1]，是國家衛(wèi)生部公布的69 種藥食同源的物質(zhì)之一。國內(nèi)外學(xué)者的大量研究發(fā)現(xiàn)，決明子富含蒽醌類化學(xué)物質(zhì)[2]，大黃酚為其中一種。研究表明，大黃酚具有止咳、抗菌、止血作用[3-6]，并能促進(jìn)腸管蠕動、神經(jīng)興奮、肌肉麻痹[7-8]和明顯的抗衰老作用[9]。因此，研究決明子中大黃酚的提取極具應(yīng)用價值。目前大黃酚的提取方法主要有回流提取[10]，超臨界CO2提取[11]、微波輔助提取[12]等。這些方法各具優(yōu)點，但也存在一些不足。如回流提取法耗時較長，且不利于對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取。超臨界提取設(shè)備相對昂貴。密閉式微波輔助提取對提取罐材料強(qiáng)度和密封性要求很高，樣品處理量小，安全性差。近年來未見將超聲波和開放式微波相結(jié)合用于大黃酚提取的報道。筆者以決明子為原料，探討并優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取大黃酚的工藝條件，旨在為決明子的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材、儀器與試劑

藥材：決明子(炒)，購于四川德仁堂中藥飲片有限公司自貢同盛大藥房，洗凈晾干，粉碎成粗粉，過40目篩，備用。大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所)。

儀器：CW-2000型超聲波-微波協(xié)同萃取儀(新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司)，AR1140型電子分析天平(奧豪斯國際上海有限公司)，MJ-176NR型多功能粉碎機(jī)(松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社)，RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，Agilent 1100 LC液相色譜儀(美國Agilent公司)，UPK-I-20T優(yōu)普純水制造系統(tǒng)(四川成都超純科技有限公司)。

試劑：甲醇為色譜純，其余試劑為國產(chǎn)分析純，試驗用水均為超純水，由優(yōu)普純水制造系統(tǒng)制備。

1.2 決明子大黃酚的制備

由于超聲波頻率(40KHz)、微波頻率(2 450 MHz)固定，且萃取儀將超聲波功率內(nèi)置為50 W，并且溶液溫度不可調(diào)。因此，根據(jù)儀器條件，主要選擇提取劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)，微波功率，提取時間和料液比四個影響因素進(jìn)行考查。

1.3 不同因素的考察

1.3.1 乙醇濃度 準(zhǔn)確稱取1.000 g決明子粗粉8份，固定料液比為1∶5(g/g)，提取時間30 min，微波功率60 W，考察乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%和80%的提取率。

1.3.2 微波功率 準(zhǔn)確稱取1.000 g決明子粗粉5份，固定料液比1∶5(g/g)，提取時間30 min，提取劑為60%乙醇，考察微波功率分別為50 W、60 W、70 W、80 W和90 W的提取率。

1.3.3 提取時間 準(zhǔn)確稱取1.000 g決明子粗粉5份，在料液比1∶5(g/g)，提取劑為60%乙醇，微波功率60 W時，考察提取時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min時的提取率。

1.3.4 料液比 準(zhǔn)確稱取1.000 g決明子粗粉5份，提取劑為60%乙醇，提取時間30 min，微波功率60 W時，考察料液比(g/g)分別為1∶3、 1∶6、 1∶9、 1∶12、 1∶15、 1∶18、 1∶21的提取率。

1.4 決明子大黃酚提取的正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以大黃酚含量為考察指標(biāo)，選擇提取劑乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取功率(D)4個主要影響因素，每個因素選取3個水平，即選用L9(34)正交試驗進(jìn)行試驗篩選最佳提取工藝，其因素水平見表1。

表1 超聲-微波協(xié)同提取決明子大黃酚的正交試驗因素及水平

1.5 大黃酚定性定量檢測

1.5.1 薄層層析 分別取供試品溶液和大黃酚儲備溶液2 μL于同一硅膠H薄層板上， 以石油醚(30～60℃)-丙酮(2∶1)為展開劑，按照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行薄層層析。若供試品在與對照品相對應(yīng)的位置上，顯示有相同斑點，置氨蒸氣中熏后，斑點變?yōu)榉奂t色則為大黃酚。

1.5.2 色譜條件 色譜柱為LichrospherC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相: 甲醇：0.1%磷酸(體積比85∶15)；流速1.00 mL/min，檢測器DAD檢測器，檢測波長為254 nm，柱溫為30.0℃，進(jìn)樣量為20 μL，見圖1。

圖1 大黃酚供試品(A) 和大黃酚對照品(B)的HPLC譜圖

Fig.1 HPLC chromatogram of the test solution(A) and the reference solution of chrysophanol(B)

1.5.3 大黃酚標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取5.0 mg大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品，無水甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，得1.0 mg/mL的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用時稀釋成所需濃度。

1.5.4 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取一定量決明子粗粉于一體化反應(yīng)器中，按料液比1∶15(g/g)加入60%的乙醇，提取時間40 min，提取功率60 W，置于超聲波-微波協(xié)同萃取儀中，將超聲波設(shè)置為開，在選定的微波功率下提取一定時間。提取液離心分離，濾液在45℃溫度下減壓濃縮至干。殘渣用甲醇于水浴溫度下溶解，并趁熱過濾。將濾液定容為100 mL，再蒸干，加稀鹽酸120 mL，置于水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖4次，每次120 mL，合并三氯甲烷溶液，回收溶劑至干。殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，即為供試品溶液，待測。

1.5.5 大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分取不同量的大黃酚儲備液，稀釋配制成6個不同質(zhì)量濃度的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按1.2.2色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=59.568x+3.225 (r=0.999 6 )，線性范圍：0～30 mg/L。

1.5.6 大黃酚含量測定 取適量供試品溶液經(jīng)0.45 μm孔徑的微孔濾膜過濾后，按照1.5.2的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，對比供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和紫外吸收曲線定性，確定出峰物質(zhì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算供試品濃度：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對大黃酚提取率的影響

由圖2可知，在不同乙醇濃度、提取時間、微波功率及料液比下大黃酚的提取含量。

1) 乙醇濃度。在乙醇濃度小于60%時，隨著乙醇濃度的增大，大黃酚得率呈上升趨勢，這可能是由于大黃酚在水中溶解度小于在乙醇中的溶解度。當(dāng)濃度為60%時，提取效果最好；隨著乙醇濃度的進(jìn)一步增大，提取效果反而略有下降。因此，乙醇濃度選擇50%、60%和70% 3個水平考察。

圖2 不同乙醇濃度、提取時間、微波功率及料液比下大黃酚的提取率

Fig.2 Chrysophanol yield under different alcohol concentration, extraction time, microwave power and solid-liquid ratio

2) 提取時間。隨提取時間的增加，大黃酚提取率呈上升趨勢。這是由于決明子細(xì)胞內(nèi)外大黃酚濃度差是超聲-微波協(xié)同提取的主要動力。在提取初期，細(xì)胞內(nèi)外大黃酚濃度差大，因此提取速率快，大黃酚提取率增加明顯；隨著時間的延長，提取劑中大黃酚濃度逐漸增大，與細(xì)胞內(nèi)濃度差逐漸變小，導(dǎo)致提取動力變小，因此提取速率減慢，大黃酚提取率增加不明顯，直至推動力為零，有效成分不再溶出；而且隨著提取時間的進(jìn)一步延長，植物組織中大量細(xì)胞破裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及較多樹脂、粘液質(zhì)等混入提取液中，使提取液中雜質(zhì)增多，粘度增大。這些雜質(zhì)不但會影響有效成分的溶出,增大傳質(zhì)阻力，而且對提取液的后續(xù)處理也極為不利。因此，當(dāng)有效成分溶出較大時，延長時間對提取不利。故提取時間選擇20 min、30 min、40 min 3個水平考察。

3) 微波功率。隨微波功率的增大，大黃酚提取率總體呈上升趨勢。但超過60 W后，提取率的增加并不明顯。這是因為隨著微波功率的增大，溶液加熱程度也隨之增大，有利于大黃酚在乙醇中的溶解，使得提取率增加。但微波功率繼續(xù)增大，微波的溫升作用更加明顯，這除了有利于大黃酚的溶出之外，還可能會導(dǎo)致乙醇和大黃酚的揮發(fā)損失，從而使大黃酚提取率增加不明顯。并且功率超過90 W還會使提取液暴沸，導(dǎo)致萃取過程不易控制，故微波功率選擇50 W和60 W、70 W 3個水平考察。

表2 超聲-微波協(xié)同提取決明子大黃酚正交試驗各處理的提取率

Table 2 Extraction efficiency of different treatment for extracting chrysophanol fromC.semenby ultrasonic wave- microwave collaborative method

處理Treatment乙醇濃度/%Ethanolconcentration料液比/(g/g)Material-liquidratio微波功率/WMicrowavepower提取時間/minExtractiontime大黃酚提取量/%Chrysophanolyield11(50)1(9∶1)1(60)1(20)1.1594212(12∶1)2(70))2(30)0.8370313(15∶1)3(80)3(40)1.496042(60)1231.8186522311.3672623122.048073(70)1321.2208832131.8556933211.2804

表3 超聲-微波協(xié)同提取決明子大黃酚正交試驗各因素水平的提取率均值與極差

4) 料液比。在決明子與乙醇的料液比較小時，隨著料液比的增加，大黃酚提取率呈上升趨勢，決明子與乙醇的料液比達(dá)1∶9(g/g)后，大黃酚提取率隨料液比的增加不再明顯。故從節(jié)約溶劑降低成本的角度考慮， 選擇料液比1∶9、 1∶12和1∶15(g/g)的3個水平考察。

2.2 超聲-微波協(xié)同提取決明子大黃酚正交試驗各處理的提取率

對決超聲-微波協(xié)同提取決明子大黃酚的正交試驗結(jié)果(表2)進(jìn)行極差分析(表3)可知，4個因素對提取率的影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時間>微波功率>料液比。通過k值可以看出，從決明子中提取大黃酚的最佳條件是A2B3C1D3，即60%的乙醇，提取時間40 min，提取功率60 W，料液比1∶15(g/g)。在該條件下，進(jìn)行6次驗證試驗，其大黃酚平均提取率為2.4 mg/g，RSD為4.8%。提取率高于以上單因素和正交試驗的結(jié)果，說明優(yōu)化方案有效提高了大黃酚的提取率，此工藝穩(wěn)定性可行。

3 結(jié)論

超聲-微波協(xié)同萃取法將超聲波和微波能有機(jī)地結(jié)合起來，充分利用超聲波的空化作用和微波的高能作用，將超聲波振動能和通過波導(dǎo)管引出的微波能共同作用于決明子，能有效提高決明子中大黃酚的提取率。試驗通過單因素和正交試驗優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同萃取決明子中大黃酚的最佳工藝條件。結(jié)果表明，在超聲波功率內(nèi)置為50 W的儀器條件下，影響超聲波-微波協(xié)同萃取決明子中大黃酚提取率的因素依次為乙醇濃度>提取時間>提取功率>料液比。優(yōu)化的最佳提取工藝為乙醇濃度60%，提取時間40 min，微波功率60 w，料液比為1∶15(g/g)。采用此優(yōu)化工藝，大黃酚提取率可達(dá)2.4%。該方法具有步驟簡單、提取時間快，提取效果好的優(yōu)點，因而具有良好的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Optimization of Ultrasonic Wave- Microwave Collaborative Extraction ofChrysophanol fromCassiaesemen

WANG Rong， ZOU Shiying， FU Dayou, ZHANG Hong, LI Yanqing

(AnalysisandTestingCenter,SichuanUniversityofScienceandEngineering,Zigong,Sichuan643000,China)

In order to make full use ofC.semenresource, the extraction technology of chrysophanol fromC.semenwas optimized by ultrasonic wave-microwave collaborative method. The effects of concentration of extracting agent, extraction time, microwave power, solid-liquid ratio were studied by single factor and L9(34) orthogonal tests. Results: When the ultrasonic wave power is fixed 50W, the optimal extraction conditions are as follows: 60% alcohol, extraction time 40 min, microwave power 60W and solid-liquid ratio 1∶15 g/g. Conclusion: The extraction yield was 2.4% under the optimal conditions.

Cassiasemen; chrysophanol; ultrasonic wave-microwave collaborative extraction; extraction process; optimization

2014-10-26； 2015-06-26修回

四川省教育廳重點項目(12ZA265)；四川理工學(xué)院科研基金項目(2011KY08)

王 蓉(1979-)，女，副教授，從事中藥活性成分提取的研究、儀器分析的教學(xué)與科研工作。E-mail:zgrtvu2008@163.com

1001-3601(2015)07-0388-0164-04

S567

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