韋 嬪， 譚艾娟， 黃弘宇， 呂世明， 王學(xué)君， 符東順， 蔣慶慶

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng)550025)

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五倍子降低大腸桿菌耐藥性的效果

韋 嬪1， 譚艾娟1， 黃弘宇1， 呂世明2*， 王學(xué)君1， 符東順1， 蔣慶慶1

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng)550025)

為探明五倍子對(duì)大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除效果和恢復(fù)對(duì)抗菌藥物的敏感性，研究五倍子提取物處理耐藥大腸桿菌E11、E22、E33、E44和E55，通過(guò)影印培養(yǎng)法篩選出耐藥性消除菌落，應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測(cè)其對(duì)抗菌藥物敏感性的變化，同時(shí)檢測(cè)消除子內(nèi)質(zhì)粒的丟失情況。結(jié)果表明：經(jīng)1/2 MIC(最小抑菌濃度)五倍子提取物作用48 h后的耐藥大腸桿菌E11、E22、E33、E44和E55對(duì)慶大霉素耐藥性的消除率分別為24.41%、11.67%、10.33%、5.33%和16.67%，遠(yuǎn)高于十二烷基硫酸鈉處理對(duì)照組(2.87%)；耐藥消除子對(duì)多種抗菌藥物的MIC值出現(xiàn)下降，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、地美環(huán)素和頭孢唑林的敏感性除個(gè)別菌恢復(fù)至中介外，均從耐藥、高度耐藥恢復(fù)至敏感，MIC值降低最高達(dá)256倍。五倍子能恢復(fù)耐藥菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，但耐藥菌的質(zhì)粒丟失與細(xì)菌耐藥性下降無(wú)相關(guān)性。

五倍子； 大腸桿菌； 耐藥性； 質(zhì)粒； 消除

大腸桿菌是人類及動(dòng)物腸道的正常寄生繁殖菌群，在環(huán)境中也廣泛存在，作為條件性致病菌，其具備接受、儲(chǔ)備和傳播耐藥遺傳因子的能力，是潛在的耐藥基因儲(chǔ)存庫(kù)或中介站，其質(zhì)粒常攜帶多種耐藥基因，以不同的方式在菌株間以較高的頻率轉(zhuǎn)移，是耐藥性傳播的重要方式[1]。近年來(lái)，隨抗菌藥物廣泛使用，尤其是不規(guī)范使用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥水平不斷增加，高度耐藥和多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重。因此，如何有效消除大腸桿菌耐藥質(zhì)粒，減少耐藥基因的傳播，對(duì)降低或消除細(xì)菌耐藥性的危害具有重要意義[2]。為此，筆者用五倍子提取物消除大腸桿菌的耐藥性及耐藥質(zhì)粒，從而使其恢復(fù)對(duì)抗菌藥物的敏感性，以減少耐藥基因的傳播，降低或消除細(xì)菌耐藥性的危害。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

藥物：五倍子，購(gòu)于西安海佳生物科技有限公司；慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、地美環(huán)素(DMCT)、四環(huán)素(TET)、磺胺嘧啶(SD)、頭孢唑林(CEF)，均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。試劑：LB培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂、MH瓊脂，均購(gòu)自上海博微生物科技有限公司；氯化鈉(NaCl，分析純)，購(gòu)于南匯彭德公社營(yíng)房化工廠；十二烷基硫酸鈉(SDS，分析純)，購(gòu)自廣東順德化學(xué)生物研究所；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 菌株

耐藥大腸桿菌E11、E22、E33、E44和E55，分離自貴州省的部分規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)，對(duì)卡那霉素、四環(huán)素、頭孢唑林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、地美環(huán)素和磺胺嘧啶均耐藥。

1.3 五倍子提取液的制備及MIC測(cè)定

將中藥五倍子按劉玉慶等[3]的方法煎煮提取后濃縮，使藥液中生藥含量為1 g/mL，115℃滅菌25 min，保存于4℃冰箱備用。參照文獻(xiàn)[3-6]的方法測(cè)定五倍子提取液對(duì)耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值。

1.4 耐藥質(zhì)粒消除子的篩選與鑒定

在LB肉湯培養(yǎng)基中加入五倍子提取液，使肉湯中五倍子的濃度為1/2 MIC，再分別加入耐藥大腸桿菌(菌落數(shù)為5×l05CFU/mL)，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，同時(shí)設(shè)不加藥物的空白組和SDS對(duì)照組；然后再劃線培養(yǎng)于無(wú)藥LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后隨機(jī)挑取300個(gè)菌落，按照影印培養(yǎng)法[7-8]用無(wú)菌牙簽分別挑取菌落對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于含GEN的MH瓊脂平板及無(wú)藥MH瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取在含慶大霉素平板上不生長(zhǎng)而在無(wú)藥平板上生長(zhǎng)的菌落，在LB固體培養(yǎng)基上傳代后，再次接種在含慶大霉素平板上證實(shí)不生長(zhǎng)的細(xì)菌，即為消除子。根據(jù)耐藥性消除菌落數(shù)與檢測(cè)菌落總數(shù)之比，計(jì)算大腸桿菌耐藥性的消除率[9]。

1.5 菌株的質(zhì)粒分析和耐藥表型變化

通過(guò)提取5株耐藥大腸桿菌及其相應(yīng)消除子的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察耐藥性消除后菌株質(zhì)粒是否丟失。參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用微量肉湯稀釋法測(cè)定5株大腸桿菌及其消除子對(duì)GEN、KAN、CIP、OFL、DMCT、TET、SD和CEF的MIC值，對(duì)比分析耐藥性消除前后的耐藥表型變化和藥物敏感性的恢復(fù)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子提取液對(duì)大腸桿菌的MIC值

經(jīng)測(cè)定，五倍子提取液對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果，對(duì)大腸桿菌E11、E33和E55的MIC值均為7.81 mg/mL，對(duì)大腸桿菌E22和E44的MIC值均為15.62 mg/mL。

2.2 對(duì)慶大霉素耐藥性的消除

從表1看出，五倍子對(duì)菌株耐藥性表現(xiàn)出一定的消除效果，作用24 h后，對(duì)耐藥菌株的最高消除率可達(dá)22.33%，平均消除率為12.53%；48 h后最高消除率可達(dá)24.41%，平均消除率為13.68%，對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除率均高于十二烷基硫酸鈉組。未經(jīng)藥物處理的空白對(duì)照的耐藥性自發(fā)消除率為0，說(shuō)明細(xì)菌耐藥質(zhì)粒無(wú)法自然丟失。

2.3 耐藥性消除前后菌株的質(zhì)粒

大腸桿菌經(jīng)五倍子提取液作用48 h后，除E11和E55菌株質(zhì)粒條帶沒(méi)有丟失外，E22和E33均丟失了2條質(zhì)粒條帶，E44丟失1或3條質(zhì)粒條帶(圖示)，說(shuō)明中藥五倍子有消除大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的效果。

表1 五倍子提取物處理后5株大腸桿菌對(duì)慶大霉素耐藥性的消除率

Table 1 Elimination rate of 5E.colistrains treated with Galla Chinensis extract to Gentamicin resistance

組別Groups時(shí)間/hTime菌株消除率/%EliminationrateofstrainsE11E22E33E44E55平均五倍子2422.3311.679.333.6715.6712.53 GallaChinensis4824.4111.6710.335.3316.6713.68十二烷基硫酸鈉SDS241.674.670.6723.672.54 Sodiumdodecylsulfate48250.672.6742.87空白對(duì)照CK2400000048000000

注：M為5 000 DNA Mark，1為E11，2為E22，3為E33，4和5為E11消除子，6為E22消除子，7為E33消除子，8～10為E44消除子，11為E55消除子，12為E44，13為E55。

Note: M, 5000DNA Marker; 1, E11; 2, E22; 3, E33; 4 and 5, Drug resistant colony of E11; 6,Drug resistant colony of E22; 7, Drug resistant colony of E33; 8～10, Drug resistant colonies of E44; 11, Drug resistant colony of E55; 12, E44; 13, E55.

圖示 耐藥大腸桿菌質(zhì)粒消除前后的圖譜

注：S表示敏感，I表示中介，R表示耐藥。

Note: S, Susceptibility; I, Intermediary; R, Resistance.

2.4 耐藥性消除前后細(xì)菌的耐藥表型

從表2看出，未經(jīng)五倍子提取液作用前，5株大腸桿菌對(duì)8種抗菌藥物均耐藥，經(jīng)五倍子消除處理后，除對(duì)磺胺嘧啶的MIC值變化較小外，其余藥物的MIC值均下降，其中，對(duì)卡那霉素、慶大霉素從高度耐藥均恢復(fù)敏感，對(duì)頭孢唑啉除E22變?yōu)橹薪橥馄溆?株均由高度耐藥恢復(fù)至敏感，對(duì)地美環(huán)素除E44變?yōu)橹薪橥饩赡退幓謴?fù)至敏感。

3 結(jié)論與討論

3.1 五倍子抑制大腸桿菌的效果

中藥是純天然物質(zhì)，具有來(lái)源廣泛、安全可靠、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在中國(guó)應(yīng)用于動(dòng)物和人類已有幾千年的歷史[10]，有些中藥成分具有抑菌作用，可以消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒[11]。五倍子作為傳統(tǒng)中藥，有斂肺澀腸功效，對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好。研究結(jié)果表明，五倍子提取液對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制作用，與馬馳[12]的研究結(jié)果一致。五倍子提取液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌濃度不同，原因可能是與不同耐藥菌株的耐藥程度和耐藥機(jī)制不同有關(guān)[13]。

3.2 五倍子對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除

研究結(jié)果表明，空白對(duì)照組大腸桿菌的耐藥性消除率為0，表明耐藥大腸桿菌其質(zhì)粒自然丟失的概率極低，而五倍子對(duì)耐藥大腸桿菌的耐藥性具有消除作用，但對(duì)不同菌株耐藥性的消除率不同，作用48h后對(duì)E11耐藥性的消除率為24.41%，對(duì)E44僅為5.33%；且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其消除率均有所提高，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

3.3 五倍子可致大腸桿菌質(zhì)粒丟失

測(cè)定結(jié)果表明，五倍子提取液可使細(xì)菌丟失質(zhì)粒條帶，質(zhì)粒條帶丟失的消除子對(duì)抗菌藥物的耐藥性明顯降低，與馬馳[12]、舒剛等[14]的研究結(jié)果一致。但五倍子引起細(xì)菌質(zhì)粒丟失的難易程度和順序，以及質(zhì)粒丟失與耐藥譜型變化的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

3.4 五倍子可使耐藥大腸桿菌的敏感性恢復(fù)

五倍子提取液作用后耐藥菌對(duì)慶大霉素、卡那霉素、地美環(huán)素和頭孢唑林的敏感性恢復(fù)程度較大，除個(gè)別菌外其他從耐藥恢復(fù)至敏感，其最小抑菌濃度(MIC)降低最高達(dá)256倍，多數(shù)藥物的MIC值出現(xiàn)下降。說(shuō)明，五倍子可在一定程度上恢復(fù)耐藥菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，但五倍子使耐藥菌的質(zhì)粒丟失與細(xì)菌耐藥性下降未呈相關(guān)性，有些消除子雖然其質(zhì)粒條帶沒(méi)有丟失，但其耐藥性也明顯降低，其原因可能是部分決定耐藥基因的小分子轉(zhuǎn)座子或插入序列被消除，由于堿基數(shù)量少，因此在質(zhì)粒的凝膠電泳圖譜上沒(méi)有區(qū)別[15]；也有可能是因?yàn)橹兴幾饔脵C(jī)理還不明確，作用后質(zhì)粒條帶雖未丟失，但致使菌株攜帶的耐藥基因發(fā)生突變而不表達(dá)[16]。

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(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Effects of Galla Chinensis on Drug Resistance ofEscherichiacoli

WEI Pin1, TAN Aijuan1, HUANG Hongyu1, LV Shiming2*,WANG Xuejun1, FU Dongshun1, JIANG Qingqing1

(1.CollegeofLifeScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The elimination drug resistance colonies were screened from 5E.colistrains (E11,E22,E33,E44and E55)treated with Galla Chinensis extract by replica plating method. The antibiotic susceptibility and plasmid loss of elimination drug resistance colonies were detected by micro-broth dilution method to explore the elimination effects of Galla Chinensis on drug resistant plasmid and restoring antibiotic susceptibility ofE.colii strains.Results:The elimination rate of E11, E22, E33, E44 and E55E.colistrains with drug resistance treated with 1/2 MIC ( minimum inhibition concentration) Galla Chinensis extract after 48 h to Gentamicin resistance is 24.41%, 11.67%, 10.33%, 5.33% and 16.67% respectively, significantly higher than Sodium dodecyl sulfate treatment (2.87%).MIC value of drug resistant elimination colonies against multiple antibacterial agents reduces and the susceptibility of drug resistant elimination colonies against Gentamycin, Kanamycin, Demeclocycline and Cefazolin recovers from drug resistance and high drug resistance except for individual colonies. MIC value of drug resistant elimination colonies can decrease by 256 times compared with original drug resistant elimination colonies. Galla Chinensis can recover the susceptibility of drug resistant bacteria against antibacterial agents but plasmid loss of drug resistant bacteria is not related to reduction of drug resistance of bacteria.

Galla Chinensis;Escherichiacoli; drug resistance; plasmid; elimination

2015-03-25； 2015-07-09修回

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目“豬肉食品安全保障關(guān)鍵技術(shù)研究”[黔科合SY字(2012)3060]；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目“中藥消除大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的研究”(研農(nóng)2015013)

韋 嬪(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：細(xì)胞功能成分研究與利用。E-mail:425702628@qq.com

*通迅作者：呂世明(1963-)，男，教授，博士，從事獸醫(yī)藥理學(xué)及毒理學(xué)研究。E-mail:lvlvsm@163.com

1001-3601(2015)07-0381-0137-03

S858.28

A