莫熙禮， 吳彤林， 李松克， 李本華， 江厚成， 武華文

(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 興義 562400)

?

黑粉病菌對(duì)薏苡生長(zhǎng)及其細(xì)胞壁降解酶活性變化的影響

莫熙禮， 吳彤林， 李松克， 李本華， 江厚成， 武華文

(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 興義 562400)

為了解薏苡黑粉病菌的致病性機(jī)制，對(duì)種子接種黑粉病菌后的發(fā)芽率和幼芽生長(zhǎng)抑制作用、黑粉病菌在薏苡不同生長(zhǎng)期的侵入危害及接種黑粉病菌后薏苡種子分泌產(chǎn)生的角質(zhì)酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：黑粉病菌對(duì)種子的發(fā)芽無(wú)抑制作用，對(duì)幼芽的生長(zhǎng)有一定的抑制作用；接種黑粉病菌孢子后，種子發(fā)病率為75.7%，而葉片和穗部的發(fā)病率都低于10%；病原菌處理種子后，角質(zhì)酶的活性在6 h和12 h出現(xiàn)峰值，略高于對(duì)照，其余時(shí)間角質(zhì)酶活性與對(duì)照差異不明顯，且角質(zhì)酶的含量和活性均較低；細(xì)胞壁降解酶的活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，種子接觸黑粉病菌后，果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性與對(duì)照的PMG活性差異不顯著，且活性的變化率相同；多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24 h內(nèi)迅速升高，達(dá)到峰值，之后迅速下降，與健康植株(CK)的活性差異不顯著，且變化規(guī)律相同。

薏苡; 黑粉病; 發(fā)病率; 種子發(fā)芽率; 幼芽生長(zhǎng)抑制; 細(xì)胞壁降解酶活性

薏苡黑粉病是一種真菌性病害，由薏苡黑粉菌屬黑粉病菌(Ustffagocoic-sbref)引起，是我國(guó)薏苡生產(chǎn)上危害最重的病害之一，可使產(chǎn)量下降30%～50%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)80%。近年來(lái)，隨著我國(guó)薏苡種植規(guī)模的擴(kuò)大，薏苡黑粉病大面積頻繁發(fā)生，而且呈逐年上升趨勢(shì)，已成為薏苡生產(chǎn)的重要制約因素。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)薏苡黑粉病的發(fā)生規(guī)律、生物學(xué)特性、致病機(jī)制等方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，僅在防治方面有部分報(bào)道[1-3]。角質(zhì)層和細(xì)胞壁是植物病原菌成功入侵植物需克服的兩道屏障，植物病原物則是通過(guò)合成和分泌各種細(xì)胞壁降解酶，降解植物體表的角質(zhì)，降低植物自身的防御能力，利于病原菌的侵入[4-5]。筆者從薏苡黑粉病菌的侵入時(shí)期、侵入部位以及病菌產(chǎn)生的角質(zhì)酶、果膠酶、纖維素酶的活性分析等方面，研究黑粉病菌的侵入關(guān)鍵時(shí)期、關(guān)鍵部位以及病原菌分泌產(chǎn)生各類致病相關(guān)酶在致病過(guò)程中所起的作用，為研究薏苡黑粉病菌的致病性機(jī)制以及薏苡黑粉病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

薏苡品種為晴薏白03-6，由黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院吳彤林教授提供。

薏苡黑粉病菌采集于黔西南州農(nóng)作物科學(xué)研究所薏苡示范基地。在薏苡果實(shí)上采集分離得到病瘤，風(fēng)干后存放于紙盒內(nèi)，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前將病瘤碾碎并過(guò)40目篩，得到菌粉，用蒸餾水將菌粉配成厚垣孢子濃度為1×104的懸浮液備人工接種。

1.2 種子發(fā)芽率和幼芽生長(zhǎng)試驗(yàn)

薏苡種子經(jīng)5%石灰水浸種24 h后，取出用清水清洗干凈并晾干。將種子放入雙層濾紙的大培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，用1×104孢子懸浮液噴霧種子，噴霧量為濾紙濕透，以蒸餾水為對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于25℃黑暗恒溫箱中培養(yǎng)48 h(露白)后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。露白后，將培養(yǎng)皿放入25℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，并測(cè)量幼芽的長(zhǎng)度，每次隨機(jī)測(cè)量10顆種子幼芽的長(zhǎng)度，每個(gè)處理5次重復(fù)。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/測(cè)定總種子數(shù))×100%

1.3 黑粉病菌對(duì)薏苡不同生育期的侵入試驗(yàn)

薏苡接菌時(shí)間設(shè)3個(gè)處理(時(shí)期)，分別為種子露白期、薏苡4葉期和薏苡抽穗期。處理1(種子+接菌)，薏苡種子經(jīng)5%石灰水浸種24 h，取出用清水清洗干凈并晾干，放入有雙層濾紙的大培養(yǎng)皿中，置于25℃黑暗恒溫箱中培養(yǎng)48 h，露白后接種濃度為1×104的孢子懸浮液，接種的量以全部種子表面形成水膜為宜。處理2(葉片+接菌)，薏苡4葉期接種濃度為1×104的孢子懸浮液，噴施的量以全部葉片上剛形成水滴為宜。處理3(抽穗+接菌)，在薏苡抽穗期接種濃度為1×104的孢子懸浮液，噴施的量以穗部剛形成水滴為宜。各處理均以清水作對(duì)照(CK)，每處理3次重復(fù)。收獲期統(tǒng)計(jì)各處理黑粉病的發(fā)病株數(shù)，并計(jì)算發(fā)病率。

發(fā)病率=(發(fā)病的株數(shù)/各處理的總株數(shù))×100%

1.4 種子接菌處理后細(xì)胞壁降解酶活性的變化試驗(yàn)

1.4.1 角質(zhì)酶 稱取1 g處理后的種子，加入4 mL的角質(zhì)酶提取液，冰浴研磨，4℃,1 000 r/min離心10 min，取上清液即為角質(zhì)酶的粗提取液。角質(zhì)酶提取液配制及角質(zhì)酶活性的測(cè)定參考吳潔云[6]的方法，分別測(cè)定處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h角質(zhì)酶活性的變化。以1 mg酶蛋白1 min內(nèi)吸光值為酶單位(U/mg)。

1.4.2 果膠酶 酶粗液的提取方法同1.4.1，果膠酶提取液的配制、多聚半乳糖酸酶(PG)以及果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的測(cè)定參考李寶聚[7]的方法。分別測(cè)定處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h多聚半乳糖酸酶(PG)以及果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的變化。50℃酶解30 min，以1 h/mg蛋白催化底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量(U/mg)為1個(gè)酶活力單位。

1.4.3 纖維素酶 酶粗液的提取方法同1.4.1。纖維素酶提取液的配制、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(EG)活性和β-葡聚苷酶的活性的測(cè)定參考董小梅[8]的方法。分別測(cè)定處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)活性和β-葡聚苷酶活性的變化。50℃酶解30 min，以1 h/mg蛋白催化底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量(U/mg)為一個(gè)酶活力單位。

以上試驗(yàn)均以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑粉病菌對(duì)薏苡的發(fā)芽率和幼芽生長(zhǎng)的影響

由表1看出，黑粉病菌孢子懸浮液處理后，種子的發(fā)芽率為87.21%，與清水對(duì)照相比差異不顯著。而病菌孢子懸浮液處理后，幼芽的生長(zhǎng)長(zhǎng)度為17.35 cm，明顯低于清水對(duì)照。說(shuō)明，黑粉病菌對(duì)薏苡種子的發(fā)芽率無(wú)影響，而對(duì)幼芽生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

表1 黑粉病菌孢子懸浮液處理薏苡的發(fā)芽率和幼芽長(zhǎng)度

Table 1 Germination rate and bud length of Coix lacrymajobi withUstffagocoic-sbrefspore suspension

項(xiàng)目Items發(fā)芽率/%Germinationrate幼芽長(zhǎng)度/cmBudlength黑粉病菌Ustffagocoic-sbref87.2117.35清水(CK)Clearwater89.5619.54

2.2 黑粉病菌在薏苡不同生育期的侵入情況

從表2看出，黑粉病在薏苡生長(zhǎng)的不同時(shí)期其危害程度不同。其中，種子+接種黑粉病菌孢子處理的薏苡黑粉病在抽穗期的發(fā)病率達(dá)75.7%，而葉片+接菌和抽穗+接菌處理的發(fā)病率均低于10%。表明，薏苡黑粉病菌主要為種子侵入，不能或很少?gòu)娜~片和穗部侵入危害。

表2 薏苡不同生育期接種黑粉病菌后的發(fā)病率

圖示 接種黑粉菌后種子角質(zhì)酶、多聚半乳糖酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡聚苷酶的酶活

Fig. Cutinase, polygalacturonase (PG), polymethyl galacturonate (PMG), β-1,4-endoglucanase(Cx) and β-galactosidase activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated withUstffagocoic-sbref

2.3 接菌后薏苡種子細(xì)胞壁降解酶活性的變化

由圖示看出，種子接菌后：1) 角質(zhì)酶。種子角質(zhì)酶的活性在6 h和12 h出現(xiàn)峰值略高于對(duì)照，其余時(shí)間差異不明顯。在整個(gè)檢測(cè)周期，角質(zhì)酶的含量和活性都較低。說(shuō)明，角質(zhì)酶在薏苡黑粉病菌的侵入過(guò)程中可能不起作用。2) 細(xì)胞壁果膠酶。多聚半乳糖酸酶(PG)活性能迅速升高，在24 h達(dá)到峰值，以后逐漸下降，且活性顯著高于對(duì)照。說(shuō)明，PG酶在黑粉病菌侵入薏苡過(guò)程中起重要作用。果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性在6 h出現(xiàn)，之后逐漸的下降，但變化幅度小，與對(duì)照間差異不顯著，且活性的變化率相同。由此推斷，PMG酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽過(guò)程中起的作用可能較小。3) 纖維素酶。種子接菌后，β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)活性在12 h時(shí)迅速升高，顯著高于對(duì)照，之后逐漸下降，且變化規(guī)律與對(duì)照相同；對(duì)照的β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶活性在整個(gè)檢測(cè)階段無(wú)顯著的變化。由此判斷，β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽后12 h起重要的作用。種子接菌后，β-葡聚苷酶的活性迅速升高，在24 h達(dá)峰值，此后下降與對(duì)照的β-葡聚苷酶活性相差不大。說(shuō)明，β-葡聚苷酶在黑粉病菌侵入種子幼芽24 h內(nèi)起重要作用。

3 結(jié)論與討論

1) 黑粉病主要危害薏苡的幼芽，侵染時(shí)期限于二葉期之前，芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度超過(guò)20 cm后，其危害的幾率迅速下降[9]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，孢子懸浮液對(duì)種子的發(fā)芽無(wú)抑制作用，對(duì)幼芽的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。種子接觸黑粉病菌孢子后，收獲時(shí)期薏苡果實(shí)的黑粉病發(fā)病率為75.7%，而葉片和穗部接觸病菌孢子后，引起薏苡黑粉病發(fā)病率都低于10%。因此，判斷薏苡黑粉病菌主要從種子侵入危害，不能或很少能從葉片和穗部入侵。

2) 角質(zhì)層是阻止病原真菌侵入寄主植物的第一道屏障，很多植物病原菌通過(guò)合成和分泌角質(zhì)酶迅速降解寄主植物的角質(zhì)，降低其防御能力，以達(dá)到侵害目的[2]，且病原物的致病性與角質(zhì)酶的表達(dá)量呈正相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，病原菌處理種子后，角質(zhì)酶的活性在6 h和12 h出現(xiàn)峰值略高于對(duì)照，其余時(shí)間角質(zhì)酶活性與對(duì)照差異不明顯，且角質(zhì)酶的含量和活性都較低。低含量和低活性的角質(zhì)酶可以沖破幼芽薄薄的一層角質(zhì)層，侵入到薏苡的幼芽組織中。而出土后的薏苡葉片和穗部表面的角質(zhì)層較厚，且常常附有一層蠟質(zhì)層，因此，低濃度和低活性的角質(zhì)酶不能沖破這一道屏障。這可能是黑粉病菌不能或很少能侵入薏苡的葉片和穗部的原因。

3) 植物病原真菌要成功地侵入寄主植物，必須刺穿細(xì)胞壁，即病原真菌侵入的第二道屏障。很多植物病原真菌通過(guò)分泌細(xì)胞壁降解酶降解細(xì)胞壁(果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶)，從而達(dá)到危害寄主植物的目的[3]。本研究對(duì)細(xì)胞壁降解酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，種子接觸黑粉病菌后，果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性與對(duì)照的PMG活性差異不顯著，且活性變化率相同，這可能是PMG在黑粉病菌侵入幼芽過(guò)程中不起作用；而多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24 h內(nèi)迅速升高達(dá)到峰值，之后迅速的下降與健康(CK)的植株的活性差異不顯著，且變化規(guī)律相同。說(shuō)明黑粉病菌24 h內(nèi)大量分泌各種細(xì)胞壁降解酶破壞組織細(xì)胞壁侵入寄主細(xì)胞，且侵入薏苡幼芽后，并沒(méi)有短時(shí)間內(nèi)迅速破壞寄主組織或者從組織中獲取大量的養(yǎng)分，而是與幼嫩的組織共存，隨著生長(zhǎng)點(diǎn)向上移動(dòng),這可能是種子感染黑粉病菌后，葉片很少發(fā)現(xiàn)病癥，而穗部的癥狀很嚴(yán)重的原因。其作用方式和作用機(jī)理有待更深一步的研究。

[1] 楊巨芒,蒲文生.紫云縣薏苡黑粉病發(fā)生原因及防治對(duì)策[J].植物醫(yī)生,2002,15(3)：13-14.

[2] 張國(guó)珍.幾種植物揮發(fā)油防治薏苡黑粉病的初步研究[J].中國(guó)中藥雜志,1995(11):657.

[3] 趙楊景,高微微.薏苡黑粉病的非化學(xué)防治[J].中藥材,1993,16(12):5-6.

[4] Purdy R E,Kolattukudy P E.Hydrolysis of plant cutin by plant pathogens.Purification,amino acids comppsition,and molecular weight of tow isoenzymes of cutinase and a nonspecific esterase from Fusarium solani f.pisi[J].Biochemistry，1975,14:2824-2831.

[5] 楊 媚,楊迎青,鄭 麗,等.水稻紋枯病菌細(xì)胞壁降解酶的組分分析、活性測(cè)定及其致病作用[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2012,26(5)：599-605.

[6] 吳潔云.灰葡萄孢角酶、細(xì)胞壁降解酶種類及其對(duì)番茄植株的致病作用[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2007:21-24.

[7] 李寶聚,陳立芹,孟偉軍,等.溫濕度調(diào)控對(duì)番茄灰霉病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的影響[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(3)：209-212.

[8] 董小梅.龍眼焦腐病菌細(xì)胞壁降解酶及其致病機(jī)理的研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2010:12-14.

[9] 高微微,趙楊景,李先恩.薏苡對(duì)黑粉病的抗性與苯丙氨酸解氨酶的關(guān)系初探[J].中國(guó)中藥雜志，1995,22(4):203-204.

[10] Ofir D,Shimon G,Carlos G D.Potental use of cutinase in enzymatic scouring of cotton fiber cuticle[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2002,102:277-289.

(責(zé)任編輯： 聶克艷)

Effects ofUstffagocoic-sbrefon Growth and Cell Wall Degrading-enzyme Activity ofCoixlacrymajobi

MO Xili, WU Tonglin, LI Songke, LI Benhua, JIANG Houcheng, WU Huawen

(QianxinanVocationalandTechnicalCollegeforNationality,Xingyi,Guizhou562400,China)

The activity of cutinase and cell wall degrading enzymes (polymethyl galacturonase PMG, polygalacturonase PG, β-1,4-endoglucanase Cx and β-galactosidase) ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefwas detected to understand the pathogenicity mechanism and study effects ofUstffagocoic-sbrefon seed germination rate and bud growth. The results showed thatUstffagocoic-sbrefhas no inhibition effect on seed germination and a certain inhibition effect on bud growth. The disease rate ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefis 75.7% but disease rate ofUstffagocoic-sbrefleaves and spikes is lower than 10%. The cutinase activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculatedUstffagocoic-sbrefreaches the peak value after 6 h and 12 h respectively, slight higher than CK. There is no obvious difference in cutinase activity but the cutinase content and activity both are lower during other time. PMG activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefis no difference with CK and the variation rate of PMG activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefand CK is the same. The PG, Cx and β-galactosidase activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefreaches the peak rapidly within 24 h, then drops rapidly and finally is no difference with healthy plants of CK.

Coixlacrymajobi;Ustffagocoic-sbref; disease rate; seed germination rate; growth inhibition; young buds; activity of cell wall degrading-enzyme

2014-12-18； 2015-06-22修回

貴州省星火計(jì)劃項(xiàng)目“薏苡標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)示范推廣”[黔科合農(nóng)字(2013)5035];貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目“貴州省薏苡工程技術(shù)研究中心” [黔科合農(nóng)字(2012)11]

莫熙禮(1982-)，男，講師，碩士，從事植物病蟲(chóng)害防治教學(xué)和研究。E-mail:moxili1982@163.com

1001-3601(2015)07-0367-0080-03

S436.6

A