洪震，傅冰，傅金堯，陳盛專，季國華

(1. 麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；2.麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 麗水 323000； 3.浙江省平陽林場，浙江 平陽 325406；4.遂昌九龍山自然保護(hù)區(qū)，浙江 遂昌 323312)

中華野海棠遺傳多樣性分析

洪震1，傅冰2，傅金堯2，陳盛專3，季國華4

(1. 麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；2.麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 麗水 323000； 3.浙江省平陽林場，浙江 平陽 325406；4.遂昌九龍山自然保護(hù)區(qū)，浙江 遂昌 323312)

利用SRAP-PCR方法研究了8個不同種源中華野海棠的遺傳多樣性。結(jié)果表明：8個中華野海棠種質(zhì)資源被劃分為2大類群，其中遂昌、景寧、慶元、泰順、武夷山種源聚成1個類群；平陽、松陽、云和種源聚成另外個類群；遺傳相似性系數(shù)界于0.4230～0.9615，平均相似性系數(shù)為0.71。

SRAP-PCR；中華野海棠；遺傳多樣性

中華野海棠(Brediasinensis)，為野牡丹科野海棠屬常綠灌木，花瓣粉紅色至紫紅色，優(yōu)美艷麗，葉形美觀，葉色翠綠有光澤，葉與花均有很高的觀賞價值[1]。同時，該種具有較高的藥用價值，全株供藥用，在浙江民間常用其治小兒腹瀉、感冒、頭痛以及瘧疾等病癥[2]。中華野海棠主要分布于兩廣、江西、浙江、福建等省，浙江省則分布于麗水、溫州等浙南山區(qū)，通常在海拔400～1400m的山谷、山坡、林下等地有生長。

目前，對于中華野海棠的研究較少，主要集中在移栽培養(yǎng)[3]、抗逆性研究、化學(xué)成分分析[4]、生物學(xué)特性[5]研究等方面，而對于遺傳育種、分類鑒定等方面，現(xiàn)有報道均未涉及。利用SRAP技術(shù)分析不同種源的中華野海棠的遺傳多樣性，可為分類鑒定以及良種選育等工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 供試材料

1.1.1 中華野海棠種植資源。供試8種中華野海棠種質(zhì)資源(表1)采集于浙江及福建各地。采集鮮嫩葉片后，-70℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 SRAP引物及篩選。共選擇了6個正向引物，8個反向引物用于實(shí)驗篩選，具體如表2，引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司按照相關(guān)序列合成。

表2 引物序列

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。用全氏金公司PlanZol植物基因組提取試劑盒抽提中華野海棠葉片組織的基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取基因組DNA的完整性，并用Lambda 650紫外分光光度計(PE，美國)測定濃度及質(zhì)量。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系及程序。參考前期對藍(lán)莓SRAP-PCR反應(yīng)體系及參數(shù)的研究[6]，初步確定反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。初步確定反應(yīng)體系為：dNTPs 100 μmol/ L、Taq 酶0.8U、MgCl22.5 mmol/ L、DNA 40 ng、正、反向引物各0.2 μmol/ L、1×Reaction Buffer(總體積20 μL)。PCR反應(yīng)程序為： 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，35 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，5個循環(huán)；95 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3 SARP引物篩選。以松陽種源中華野海棠基因組DNA為模板，隨機(jī)組合正、反向引物，進(jìn)行引物篩選。

1.2.4 電泳及染色。將篩選得到的引物分別以所有供試中華野海棠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Dolphin-DOC Plus凝膠成像系統(tǒng)(Wealtec，美國)分析、記錄數(shù)據(jù)。DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為MarkerIII(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法。用Dolphin-DOC Plus凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件結(jié)合人工方法讀帶，并記錄擴(kuò)增結(jié)果，其中有帶記為1，無帶記為0，并導(dǎo)入Excel表格。用NTSYS-pc2.10e分析軟件分析所得Excel表格，計算遺傳相似性系數(shù)，同時用UPGMA對不同種源進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及多態(tài)性分析

以松陽種源中華野海棠基因組DNA為模板，驗證PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，同時篩選合適的SRAP引物組合。共隨機(jī)組合了20對引物組合，電泳結(jié)果如圖1所示，從中篩選出4對能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，并且多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物組合，分別為：ME4-EM17、ME4-EM18、ME5-EM13、ME6-EM10。篩選結(jié)果同樣證明該P(yáng)CR體系是適用的。4對組合PCR后經(jīng)3.5%丙烯酰胺凝膠電泳，共擴(kuò)增出99條條帶，其中多態(tài)性條帶為60條，多態(tài)性比率為60.61%(表3)。

表3 9個引物組合的擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物篩選電泳圖

2.2 種質(zhì)資源相似性系數(shù)分析

根據(jù)4對組合PCR電泳結(jié)果(圖2為ME6-EM10引物組合電泳結(jié)果)，利用NTSYS-pc2.10e分析軟件計算樣品間的Jaccard遺傳相似性系數(shù)，結(jié)果見表4。8個中華野海棠種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)分布于0.4230～0.9615之間，平均相似性系數(shù)為0.71。其中，最高相似性系數(shù)出現(xiàn)在遂昌和景寧種源之間，為0.9615；最低相似性系數(shù)出現(xiàn)在福建和云和種源之間，為0.4230。

表4 8個中華野海棠種質(zhì)資源的Jaccard相似性系數(shù)矩陣

圖2 ME6-EM10 3.5%丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.3 種質(zhì)資源的聚類分析

圖3 8個中華野海棠種質(zhì)的UPGMA聚類圖

基于Jaccard遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖(圖3)顯示，8個中華野海棠種質(zhì)資源被劃分為兩大類群：其中遂昌、景寧、慶元、泰順、福建種源聚成一個類群(I)；平陽、松陽、云和種源聚成另一個類群(II)。類群I又可以細(xì)分成2個小的類群，其中，福建種源自成一類類群，其它4個種源為一個類群。類群II同樣也可細(xì)分成2個小的類群，分別為松陽、云和種源為一個類群；平陽種源為另一個類群。

3 討論

通過對試驗結(jié)果的分析，8種供試種質(zhì)資源遺傳相關(guān)性并不是很高，說明中華野海棠具有較豐富的遺傳多樣性。雖然除了福建武夷山種源的中華野海棠外，其它7個種質(zhì)資源均采集自浙江省麗水市及溫州市，但是這7個種質(zhì)資源之間并沒有因為分布較近而表現(xiàn)出高的親緣關(guān)系，這可能跟種質(zhì)資源的人工移栽、自然遷移[7]等因素有關(guān)。

[1]洪震，李根有，馬丹丹，等.野生花卉中華野海棠的抗逆性研究[J]．北方園藝，2012(5)：62-66.

[2]屠娟麗，周紫球，吳小華.3野生灌木中華野海棠的發(fā)芽試驗[J]．浙江林業(yè)科技，2003 (2)：24-26.

[3]張作煥，李林，陶正明.中華野海棠野生苗移栽技術(shù)初探[J]．浙江林業(yè)科技，2003(1):54-55.

[4]沈雙玲.中華野海棠化學(xué)成分及藥效學(xué)分析[D]．福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2013.

[5]馬丹丹，金清.3種野海棠屬野生花卉的光合特性研究[J]．河南林業(yè)科技，2011(3):1-3.

[6]傅冰，洪震，劉躍鈞，等.藍(lán)莓SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化及其遺傳多樣性分析[J]．北方園藝，2013(17)：95-99.

[7]鐘永德，李邁和.Norbert Kraeuchi，地球暖化促進(jìn)植物遷移與入侵[J]．地理研究，2004(3):347-353.

Analysis the Genetic Diversity ofBrediasinensis

Hong Zhen1，F(xiàn)u Bing2，F(xiàn)u Jinyao2，Chen Shengzhuan3，Ji Guohua4

(1. Lishui Academy of Forestry, Lishui ，Zhejiang 323000；2.Lishui vocational & technical college, Lishui , Zhejiang,323000; 3.Pingyang Forest Farm of Zhejiang Province,Pingyang,Zhejiang 325406；4. Jiulongshan Nature Reserve of Suichang,Suichang, Zhejiang 323312)

SRAP-PCR method was used to study the genetic diversity of 8Brediasinensisprovenances.The results indicated that: the 8Brediasinensisprovenances were divided into two groups,which provenances of Suichang County, Jingning County, Qingyuan County, Taishun County,Wuyishan City together into one group; and the other group include provenances of Pingyang County, Songyang County, Yunhe County.The GS coefficients among the 8Brediasinensisprovenances were ranged from 0.4230 to 0.9615 with an average of 0.71.

SRAP-PCR;Brediasinensis;Genetic diversity

2015-08-25

浙江省科技計劃項目(2013C32102)；麗水市科技計劃項目(20120310)

洪震(1969-)，男，高級工程師，主要從事觀賞植物開發(fā)利用研究，E-mail:452451651@qq.com。

S661.4

B

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.06.001