雷金虎

（湖南省洞口縣畜牧水產(chǎn)局石江鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站，湖南邵陽(yáng) 422000）

熒光定量PCR檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病的實(shí)踐

雷金虎

（湖南省洞口縣畜牧水產(chǎn)局石江鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站，湖南邵陽(yáng) 422000）

應(yīng)用PCR方法對(duì)湖南省邵陽(yáng)市10個(gè)生豬養(yǎng)殖基地的120份樣品（血液樣品100份，組織病料10份），以及16個(gè)規(guī)模豬樣的200份樣品（血液樣品162份，組織病料38份）逐步開(kāi)展了豬藍(lán)耳病檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即表明在豬群中沒(méi)有發(fā)生豬健康帶毒以及隱性感染的情況。

熒光定量PCR 高致病性豬藍(lán)耳病 檢測(cè) 應(yīng)用

高致病性豬藍(lán)耳病是由呼吸與繁殖綜合征病毒變異株所引起的急性高致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、患病仔豬死亡率在60%以上，患病母豬流產(chǎn)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害較大。高致病性豬藍(lán)耳病已經(jīng)引起了相關(guān)部門(mén)及養(yǎng)豬業(yè)從業(yè)者的高度重視，并通過(guò)各種手段對(duì)其開(kāi)展了一定的防治。使用PCR熒光方式對(duì)該類(lèi)病癥進(jìn)行了試驗(yàn)性的檢測(cè)，認(rèn)真總結(jié)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，希望對(duì)同行有所幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

生物安全柜、熒光PCR儀以及高速冷凍離心機(jī)。

1.2 試劑

病毒RNA提取盒以及熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

來(lái)自湖南省邵陽(yáng)市16個(gè)生豬養(yǎng)殖區(qū)域以及20個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的淋巴結(jié)、脾等組織以及血液樣品。

1.4 操作方式

1.4.1 樣本處理

對(duì)于血液樣品，我們需要將其通過(guò)離心機(jī)離心2 min，并取100 μl的血清同300 μl混合搖勻。之后，再取0.5 g的組織樣品將其加入pH值為7.2、1.5 ml的PBS，并在研磨之后將其通過(guò)離心機(jī)離心2 min，取離心完畢100 μl的上清液加入300 μl，變形液混合搖勻。

1.4.2 模板制備

在此環(huán)節(jié)中，我們需要先取一定數(shù)量經(jīng)過(guò)DEPC處理完畢的離心管，并向其中加入30μL的處理樣品以及醋酸鈉溶液，經(jīng)過(guò)反復(fù)顛倒、搖勻之后，將其通過(guò)離心機(jī)以高速離心15 min，并對(duì)搖勻之后的混合液取其上層清液降入300 μl的異丙醇后搖勻，將其放置在液氮中。3 min后，我們則可以將其取出并放在室內(nèi)，在其融化之后再將其通過(guò)離心機(jī)離心20 min，并在混勻之后向其中加入1 ml量的乙醇，搖勻之后以真空方式將其抽干15 min，最后再向其中加入10 μLRNA酶抑制劑同離子水的混合液，將其放置在零下25℃的環(huán)境中留存后用。

1.5 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備

根據(jù)我們本次試驗(yàn)所需要的反應(yīng)管總數(shù)，我們則需要對(duì)溶液中所具有的試劑球數(shù)進(jìn)行計(jì)算，并在每一個(gè)試劑球上都需要對(duì)其施加0.5 μl的taq酶以及30 μl球溶液。而在冰上試劑的溶解方面，我們則需要對(duì)其以較輕的力度進(jìn)行叩擊，使其能夠以充分的方式混勻，并避免出現(xiàn)旋渦振蕩情況。在此過(guò)程中，我們也需要對(duì)所使用的不同級(jí)聯(lián)工具進(jìn)行細(xì)致的計(jì)算，并將其中加入經(jīng)過(guò)DEPC水處理的1.5 ml溶液到離心管中，在混合充分之后使用離心機(jī)對(duì)其離心10 s，之后再向其中加入5μl樣本并將其放置到對(duì)照管中，且在管蓋封閉之后將其放到熒光PCR儀器中。

2 結(jié)果分析

2.1 判定標(biāo)準(zhǔn)

如果經(jīng)過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣本所具有的Ct值在35以下，且其發(fā)展曲線呈現(xiàn)出一種較為明顯的增長(zhǎng)期，我們則可以將其判定為陽(yáng)性；如果經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)樣本所具有的Ct值在35～40之間，并在重復(fù)檢測(cè)時(shí)檢測(cè)值依然處于該區(qū)間內(nèi)、曲線具有較為明顯的增長(zhǎng)期，我們也可以將該種情況判定為陽(yáng)性。而如果我們經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)樣本所具有的Ct值大于40或者根本就檢測(cè)不到Ct值，則可以將其判定為陰性。

2.2 敏感性試驗(yàn)

對(duì)于部分一直患有藍(lán)耳病、表現(xiàn)為陽(yáng)性的樣本來(lái)說(shuō)，我們需要通過(guò)紫外分光光度法對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)過(guò)初步檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)濃度為4.87×109，且在對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋10倍后，依然能夠檢測(cè)到其濃度為10-7，這也充分顯示出了我們所使用PCR熒光定量方式所具有的較高靈敏度。

2.3 特異性試驗(yàn)

在設(shè)定為空白對(duì)照以及非靶 DNA的情況下，我們對(duì)PCR熒光方式所具有的特異性進(jìn)行了檢測(cè)，得出檢測(cè)結(jié)果為陰性。檢測(cè)結(jié)果如下圖所示：

圖1 特異性試驗(yàn)

2.4 穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)

為了能夠?qū)Ρ敬卧囼?yàn)所具有的穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)，我們分別使用熒光PCR法對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行了3次重復(fù)性試驗(yàn)，并得出R2=0.986013，這充分說(shuō)明了在檢測(cè)Ct值小于33的情況下，試驗(yàn)結(jié)果具有較好的線性關(guān)系，即對(duì)我們所使用的檢測(cè)方式穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)論如下所示：

圖2 重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 樣品檢測(cè)

在對(duì)熒光檢測(cè)方式所具有的穩(wěn)定性以及精確性效果進(jìn)行驗(yàn)證之后，我們則以這種熒光PCR的方式對(duì)本地區(qū)16個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域120份樣品以及20個(gè)豬場(chǎng)所具有的200樣品進(jìn)行了檢測(cè)，所獲得的結(jié)果均為陰性，該檢測(cè)結(jié)果充分表明了湖南省邵陽(yáng)市豬群養(yǎng)殖中不存在患有豬藍(lán)耳病的健康帶毒以及隱形感染情況。

3 討論

（1）目前，我國(guó)對(duì)于豬藍(lán)耳病的主要診斷方式有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)以及病毒中和試驗(yàn)等等，但是無(wú)論是上述哪一種方式，都具有靈敏度較低、特異性不強(qiáng)以及操作難度大等問(wèn)題，而對(duì)于普通的PCR技術(shù)而言，雖然其近年來(lái)在技術(shù)方面已經(jīng)獲得了較大的提升，但是所具有的檢測(cè)精度依然不能夠使人滿(mǎn)意，檢測(cè)出假陽(yáng)性的情況依然存在，且在檢測(cè)的過(guò)程中很容易伴隨著EB污染物的污染，對(duì)于食用者的健康具有較大的安全隱患。而通過(guò)TaqMan熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用，則因?yàn)槠渌哂械奶禺愋?、?zhǔn)確性、敏感性以及快速性等特點(diǎn)使其在我國(guó)目前的藍(lán)耳病檢測(cè)中獲得了較為廣泛的應(yīng)用。

（2）近年來(lái)，高致病性豬藍(lán)耳病在我國(guó)的很多地區(qū)都出現(xiàn)了較多的患病病例，并對(duì)當(dāng)?shù)氐娜庳i養(yǎng)殖造成了較大的影響。面對(duì)此種情況，就需要我們能夠加大原有的地區(qū)病原學(xué)監(jiān)測(cè)力度，并做好相關(guān)的病情預(yù)警工作，最大程度避免疫情出現(xiàn)。而在我們通過(guò)多種方式做好該類(lèi)病癥的免疫操作之外，還需要做好豬群的抗體檢測(cè)，以此幫助我們對(duì)該病癥的抗體發(fā)展規(guī)律進(jìn)行更好的了解與掌握，進(jìn)而在對(duì)原有免疫程序進(jìn)行不斷完善的基礎(chǔ)上保障防控效果。

（3）通過(guò)我們本次熒光定量PCR檢測(cè)豬藍(lán)耳病的一系列實(shí)驗(yàn)，可以說(shuō)已經(jīng)對(duì)此種藍(lán)耳病的檢測(cè)方式以及檢測(cè)效果都具有了較好的掌握。而在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們也需要通過(guò)該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)更多領(lǐng)域，如，豬偽狂犬病、禽流感以及豬瘟等疫病類(lèi)型進(jìn)行檢測(cè)，以此在不斷使熒光定量PCR檢測(cè)方式所具有的檢測(cè)領(lǐng)域以及檢測(cè)范圍得到擴(kuò)大的同時(shí)，為我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障。

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