劉志杰

（山東青島即墨市畜牧獸醫(yī)局，山東即墨 266200）

豬偽狂犬病病毒gE基因核酸探針的制備

劉志杰

（山東青島即墨市畜牧獸醫(yī)局，山東即墨 266200）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒引起的一種以發(fā)熱、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的重要傳染病，國(guó)內(nèi)到目前為止，已經(jīng)有20多個(gè)省市報(bào)道有偽狂犬病流行，并分離出MinA、陜A、AKW、DQ-8401、S、鄂A、京A等多株豬偽狂犬病病毒（PRV）。OIE推薦使用基因缺失疫苗，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已決定只生產(chǎn)和使用基因缺失疫苗，目前已經(jīng)商業(yè)化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基因，本文報(bào)道了利用缺失的gE基因制備核酸探針的研究。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

PRV-S國(guó)內(nèi)分離株；PPV、PCV、PRRSV、CSFV、Vero細(xì)胞、大腸桿菌DH5α；PRV Bartha-k61株疫苗。

1.2 主要試劑

pMD-18T-Vector線狀克隆載體、Taq DNA聚合酶和DNA純化回收試劑盒、TRIZOL試劑盒、Dig標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒。

1.3 引物

PS5’－ACG ACG ATG ACC TCA ACG G－3'，PR5'－AGG TAG TCG CCG ATG CCC －3'。

1.4 病毒增殖

PRV -S株及PRV Bartha-k61株以Vero細(xì)胞培養(yǎng)。

1.5 DNA的提取

按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 PCR擴(kuò)增

以PRV病毒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆

應(yīng)用DNA快速純化回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后克隆，測(cè)序。

1.8 探針的標(biāo)記

以純化回收的PRVgE基因片段為模板進(jìn)行標(biāo)記。

1.9 標(biāo)記探針敏感性的測(cè)定

按照DNA探針標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)所制備探針的敏感性。

1.10 標(biāo)記探針特異性的測(cè)定

將PRV-S株 DNA、PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA點(diǎn)樣于NC膜上同核酸探針雜交，加底物顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV-S株gE基因的PCR擴(kuò)增

以PRV-S株DNA為模板，對(duì)其gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果出現(xiàn)一條特異性條帶，長(zhǎng)度與預(yù)期的304bp相符，結(jié)果見(jiàn)圖1：

圖1 豬偽狂犬病毒gE基因的PCR擴(kuò)增1：gE基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DL2000 DNA Marker

2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證明PCR擴(kuò)增片斷與PRV-S株gE基因同源性為100%。

2.3 核酸探針敏感性試驗(yàn)

將上述PCR擴(kuò)增的DNA片段分別按1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400進(jìn)行稀釋后進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)。試驗(yàn)可見(jiàn)當(dāng)PCR產(chǎn)物稀釋6400倍時(shí)仍可見(jiàn)到陽(yáng)性雜交信號(hào)，說(shuō)明本探針至少可檢測(cè)到4pg的DNA片段。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 核酸探針敏感性檢測(cè)

2.4 核酸探針特異性試驗(yàn)

在同一條NC膜上同時(shí)點(diǎn)上PRV-S株DNA、PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA，進(jìn)行探針的雜交試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。本探針不與PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA，而只與PRV-S株DNA有很好的反應(yīng)性，說(shuō)明該核酸探針具有良好的特異性。

圖3 核酸探針特異性檢測(cè)

3 討論

核酸探針技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，利用PRV DNA作為探針，曾檢出過(guò)10 pg，l～5 pg的PRV DNA。

在實(shí)施根除偽狂犬病計(jì)劃的近20年來(lái)，疫苗扮演了重要的角色。在各種疫苗中基因缺失疫苗是應(yīng)用最廣泛的，常見(jiàn)的缺失基因有g(shù)E、gI、TK等。gEˉ可作為標(biāo)志基因，區(qū)別PRV野毒株和gE基因缺失株。與一定的檢測(cè)方法結(jié)合，便能用免疫接種和捕殺陽(yáng)性動(dòng)物相結(jié)合的方法來(lái)根除PRV。本研究就是通過(guò)PCR擴(kuò)增了一段304 bp的豬偽狂犬病毒gE基因片段，將其作為核酸探針來(lái)對(duì)PRV野毒株進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)試驗(yàn)證明該探針只與同源DNA出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，而與PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA的雜交結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性。敏感性檢測(cè)結(jié)果表明，該探針最低可檢出4 pg的同源DNA，具有很高的靈敏度。故該探針可用于檢測(cè)偽狂犬病野毒感染。