封忠昕　章　瑩　陳　琦　肖建輝　閔　迅　馮　進

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院　1　檢驗科　2　內(nèi)分泌科　3　血液內(nèi)科，貴州省遵義市　563003；　4　貴州省細胞工程重點實驗室

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可溶性CD40配體對THP-1細胞增殖及survivin mRNA表達的影響*

封忠昕1章瑩2陳琦3肖建輝4閔迅1馮進1

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1檢驗科2內(nèi)分泌科3血液內(nèi)科，貴州省遵義市563003；4貴州省細胞工程重點實驗室

急性髓細胞白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是成年人最常見的急性白血病，是一組起源于造血干細胞的異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，白血病細胞大量聚集浸潤骨髓及組織器官中，病情極為兇險，可短期內(nèi)致死。對白血病的發(fā)病機制及生物學(xué)治療等研究是較為熱門的課題[1～3]。sCD40L屬于腫瘤壞死因子(TNF)基因超家族成員，其在腫瘤細胞抗原遞呈等方面發(fā)揮重要的作用，可顯著抑制B淋巴細胞白血病等增殖，導(dǎo)致腫瘤細胞呈現(xiàn)G1期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[4，5]。本課題組李杰等[6]前期研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的sCD40L與HL-60細胞干預(yù)時，4μg/ml作用48h時抑制增殖促進凋亡最為顯著，凋亡因子CD95表達量最高，Bcl-2表達量最低，推測可能是通過死亡受體途徑和線粒體途徑促進HL-60細胞凋亡。sCD40L能否應(yīng)用于急性粒細胞白血病其他類型，為此筆者研究sCD40L對THP-1細胞的影響，并且通過測定survivin的表達水平及細胞培養(yǎng)液上清中IL-6水平變化，探討sCD40L可能的作用機制，為人重組sCD40L 能否應(yīng)用于白血病的治療提供更多的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料白血病THP-1細胞株購自中國科學(xué)院上海生命研究院細胞資源中心，胎牛血清和RPMI1640購自美國Gibico公司； sCD40L購自以色列ProSpec公司；RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒及survivin引物均購自TaKaRa生物工程公司；IL-6酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)。THP-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組。 THP-1細胞組：不加任何藥物干預(yù)組；sCD40L實驗組：sCD40L濃度0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μg/ml；空白調(diào)零組：加入 RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS)。

1.2.3MTT細胞增殖檢測。取對數(shù)生長期 THP-1 細胞，細胞活力>90%，加入 96 孔培養(yǎng)板中，每孔細胞100μl，總體積為200μl。每組5個復(fù)孔，用完全培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清)調(diào)整培養(yǎng)體積200μl，37℃5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在終止培養(yǎng)前4h每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，培養(yǎng)終止后棄去上清，每孔用150μl DMSO溶解甲月贊顆粒，輕輕震搖10min，置酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值，檢測波長570nm。計算公式：抑制率= (1-實驗組OD值/細胞對照組OD值)×100%。

1.2.4survivin mRNA表達的測定。按 TaKaRa 說明提取各濃度各時間段的RNA，并按說明進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：

試劑使用量5×PrimeScriptTMBuffer(forRealTime)6.0μlPrimeScriptTMRTEnzymeMixⅠ1.5μlRandom6mers(100μM)1.5μlOligoDtPrimer(50μM)1.5μlTotalRNA19.5μl總反應(yīng)體積為30μl

37℃15min逆轉(zhuǎn)錄，85℃ 5s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放置-20℃冰箱保存。按說明進行實時熒光定量PCR，取1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行PCR擴增。反應(yīng)總體積為20μl，內(nèi)含SYBR?Premix Ex TaqTM10μl，引物混合液(上游、下游引物)1μl，1‰DEPC 水8μl。 預(yù)變性 95℃ 30s， 1 Cycle，PCR反應(yīng)95℃5s；60℃30s，40 Cycles。引物由TaKaRa生物工程公司合成。實驗結(jié)果以2^(-△△Ct)相對值來反映基因表達的改變。

基因上游引物(5’-3’)下游引物(3’-5’)survivinGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGCACAGCAGTGTTTGAAATGACAGGβ-actinTGGCACCCAGCACAATGATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA

1.2.5IL-6水平的測定。嚴格按照人白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒說明書的操作步驟進行：酶標包被板上分別設(shè)置空白孔、標準孔、待測樣品孔，分別加入細胞培養(yǎng)液、稀釋后的標準品、待測樣品上清各100μl，每孔均設(shè)置5個復(fù)孔。37℃反應(yīng)120min,加入第一抗體，37℃反應(yīng)60min,洗滌后加入酶標抗體工作液，37℃反應(yīng)30min,洗滌后加入底物工作液，37℃反應(yīng)15min,后加入終止液，用酶標儀在450nm波長檢測吸光度。

2結(jié)果

2.1sCD40L 對THP-1細胞增殖的影響5組不同濃度的sCD40L作用THP-1 細胞24h、48h和72h后，結(jié)果顯示，隨著sCD40L濃度增加及作用時間延長，THP-1 細胞增殖抑制率隨之增高，與細胞對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明sCD40L對THP-1 細胞增殖抑制作用具有劑量-時間依賴性。結(jié)果見表1。

2.2實時熒光定量PCR測定survivin mRNA水平的變化5組不同濃度的sCD40L作用THP-1 細胞24h、48h和72h后，結(jié)果顯示，隨著sCD40L濃度增加及作用時間延長，survivin mRNA 表達隨之下降，與細胞對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

2.3ELISA測定細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-6水平的變化5組不同濃度的sCD40L作用THP-1 細胞24h、48h和72h后，結(jié)果顯示，隨著sCD40L濃度增加及作用時間延長，IL-6表達隨之下降，與細胞對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

表1　sCD40L對THP-1細胞增殖抑制率

注：與細胞對照組比較，★P<0.05。

表2　sCD40L對THP-1 細胞survivin mRNA

注：與細胞對照組比較，★P<0.05。

3討論

AML是成年人最常見的惡性血液腫瘤，其特征是大量異常增生的白血病細胞浸潤導(dǎo)致各器官功能異常，傳統(tǒng)的FAB分型和WHO分型各有不同，隨著分子檢測等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，治療手段也不斷豐富，探測靶點等治療是當(dāng)前研究的熱點[7～9]。

CD40配體屬于腫瘤壞死因子基因超家族，主要來源于血小板、B細胞、T細胞等，CD40配體可分為sCD40L和膜結(jié)合型CD40配體兩種[10]。sCD40L是由膜結(jié)合型CD40配體裂解而成的，分子量為18KD，主要以活化三聚體的形式存在，該配體通常被認為存在兩個功能區(qū)：一個是賴氨酸-精氨酸-谷氨酸(KGD)序列，其與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體相結(jié)合；另一個是腫瘤壞死因子(TNF)同源結(jié)構(gòu)域，其與CD40相結(jié)合[11]。對于sCD40L的研究多集中于肺癌、胃癌等實體瘤，劉珊等[12]予sCD40L聯(lián)合長春瑞濱作用于肺腺癌A549細胞，研究發(fā)現(xiàn)sCD40L可抑制A549細胞的體外增殖，并不顯著增加長春瑞濱誘導(dǎo)的細胞凋亡率，且對周期時相影響不大，推測可能是通過凋亡及周期抑制以外的機制影響長春瑞濱對A549細胞的作用。但有學(xué)者持不同觀點，王天立等[13]予sCD40L作用于肺腺癌A549細胞發(fā)現(xiàn)，sCD40L可引起A549細胞的生長抑制、細胞周期和表型改變，并可引起部分凋亡基因表達的改變。李銳等[4]予sCD40L作用于胃癌細胞株AGS和BGC-823，研究發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期調(diào)控，可能成為治療胃癌的新手段。有專家認為， sCD40L為B細胞惡性腫瘤提供了一種新的靶向治療的可能[5]。本研究表明，各組濃度的sCD40L作用24h、48h、72h后，細胞增殖抑制率較細胞對照組均明顯提高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，以2.5μg/ml作用72h抑制率最顯著?？烧J為sCD40L能夠抑制THP-1細胞增殖，存在濃度時間依賴性，可能具有抗白血病效應(yīng)。有實驗表明 CD40抗原與其配體 CD40L 配基化作用,可促進慢性B淋巴白血病細胞(B-CLL)的抗凋亡基因survivin表達，也有研究發(fā)現(xiàn)白血病細胞在CD40 刺激下可分泌趨化因子IL-6、IL-12 等[14]。

圖1　sCD40L對THP-1細胞的IL-6表達的影響

注：與細胞對照組比較，★P<0.05。

survivin是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)中相對分子量最小的新成員。在正常的成熟組織中不表達或低表達，在病理狀態(tài)下, 廣泛表達于人類各種惡性腫瘤組織中, 如胃癌、大腸癌、白血病和淋巴瘤等腫瘤中[15～17]。

本實驗表明，不同濃度sCD40L與THP-1細胞共育24h、48h、72h后，survivin mRNA表達較細胞對照組均有所抑制，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，以2.5μg/ml作用72h時survivin mRNA表達最小，具有濃度-時間依賴性。說明sCD40L在體外能夠抑制THP-1細胞增殖可能與survivin mRNA表達下調(diào)相關(guān)。IL-6是一種由纖維母細胞、淋巴細胞和多種腫瘤細胞等產(chǎn)生的常見的細胞因子，可誘導(dǎo)B淋巴細胞、單核細胞等分化，參與炎癥反應(yīng)等，并能促進腫瘤生長，與多發(fā)性骨髓瘤關(guān)系密切。有研究表明，在癌癥患者中，包括宮頸癌、消化道腫瘤中高表達，并與侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18，19]。

本實驗研究顯示，sCD40L與THP-1細胞共育24h、48h、72h后，采用ELISA法測定IL-6的表達較細胞對照組均有所抑制，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，以2.5μg/ml作用72h時IL-6表達最小，具有濃度-時間依賴性，推測sCD40L在體外能夠抑制THP-1細胞增殖，可能與IL-6表達下調(diào)相關(guān)。這與熊果酸可減低THP-1細胞中IL-6水平相似[20]。

總之，0.5～2.5μg/ml 濃度的sCD40L與THP-1細胞共育24h、48h、72h后細胞增殖抑制率均有上升，具有濃度-時間依賴性。另外，上述濃度的sCD40L與THP-1細胞共育24h、48h、72h后，survivin mRNA和IL-6表達均有所下調(diào)，具有濃度-時間依賴性。這可能提示sCD40L作用THP-1細胞抑制增殖與survivin mRNA及IL-6的下調(diào)有關(guān)，故推測sCD40L有可能為CML治療提供新的思路。不過本研究僅對于體外培養(yǎng)THP-1細胞，且實驗重復(fù)次數(shù)和樣本有限，另外其體內(nèi)抗CML效果如何，是否難免產(chǎn)生耐藥性等諸多問題仍值得進一步探討。

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(編輯落落)

摘要目的：研究可溶性CD40配體(Soluble CD40 Ligand,sCD40L)對人白血病 THP-1 細胞增殖的作用，并探討其對生存素mRNA(survivin mRNA)及白細胞介素6(IL-6)表達的影響。方法：采用MTT 法檢測sCD40L孵育THP-1 細胞體外增殖的影響；通過RT-PCR檢測survivin mRNA 表達； ELISA測定IL-6的影響。結(jié)果：不同濃度的sCD40L對THP-1 細胞增殖有抑制作用，并呈劑量-時間依賴關(guān)系；sCD40L對THP-1 細胞survivin及IL-6的表達有明顯的抑制作用，并呈劑量-時間依賴性。結(jié)論： sCD40L 在體外能夠明顯抑制 THP-1 細胞增殖，具有劑量-時間依賴性。sCD40L 抑制THP-1 細胞增殖與survivin及IL-6表達相關(guān)，并可能與其下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞可溶性CD40配體THP-1細胞增殖survivin白細胞介素6

Effect of Soluble CD40 Ligand on Proliferation of THP-1 Cells and Expression of survivin mRNA

FENG Zhongxin#,ZHANG Ying，CHEN Qi,etal.#DepartmentofClinicalLaboratory，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,ZunyiCity，GuizhouProvince563003

ABSTRACTObjective:To investigate the effect of sCD40L on proliferation of THP-1 cells and expressions of IL-6 and survivin.Methods:The MTT assay was used to examine the effect of different concentrations of sCD40L on Leukemia THP-1 cells proliferation in vitro at different incubation times; RT-PCR was used to determine the effect of different concentrations of sCD40L on the expression of survivin mRNA in THP-1 cells at different incubation times;ELISA was used to detect changes in cytokine IL-6 levels in the culture supernatants of leukemia THP-1 cells of different concentrations of sCD40L at different incubation times.Results:Different concentrations of sCD40L could all significantly inhibit THP-1 cells proliferation and there was a dose-dependent tendency. sCD40L could suppress the expression of survivin and IL-6,and with dose-dependent manner.Conclusion:sCD40L can significantly inhibit the proliferation of THP-1 cells in vitro, yet it is concentration and time dependent;the mechanisms of sCD40L in inhibiting the proliferation of THP-1 cells and inducing apoptosis in THP-1 cells may be related to their inhibition of IL-6 and survivin expression.

KEY WORDSsCD40L,THP-1,Cell proliferation,survivin,IL-6

收稿日期2015-04-30

中圖分類號：R73

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)14-1852-04

*基金項目：貴州省社會發(fā)展攻關(guān)項目(黔科合SY字[2014]3025號)；貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合J字LKZ[2013]55號)。通訊作者：陳琦